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背景  要點 裂解翻轉(zhuǎn)于低溫，避免降解是根本。 抗體珠子需加足，抗體蛋白過夜孵。 蛋白豐度了于心，重鏈輕鏈已變性。 Protocol與datasheet，研讀操作需仔細(xì)。 常見問題解析 01 免疫共沉淀（Co-IP）與免疫沉淀(IP)的區(qū)別  IP  Co-IP IP：通過對某蛋白質(zhì)的富集，研究該蛋白的特性（如翻譯后修飾）。 Co-IP: 通過對某蛋白質(zhì)的富集，研究與其結(jié)合的其他蛋白（即蛋白-蛋白相互作用、蛋白復(fù)合物等）。 ? 關(guān)鍵試劑選擇：使用可以富集蛋白的抗體是Co-IP的前提，因此，適用于IP的抗體都可應(yīng)用于Co-IP。 02 Co-IP與Gst pull-down的區(qū)別 Co-IP：利用抗原抗體反應(yīng)的特異性； GST Pull down：一般指用一個帶GST標(biāo)簽的重組蛋白，與目的蛋白進(jìn)行孵育，最后用結(jié)合GST的Beads拉下相互作用復(fù)合物。 03 免疫共沉淀中的input是指什么？陰性對照的意義是什么？ input是陽性對照。免疫共沉淀實驗中，會直接取細(xì)胞裂解液進(jìn)行WB，用于驗證細(xì)胞裂解液中確實存在目的蛋白。陰性對照是用來排出污染的可能性， 當(dāng)陰性對照（即lgG對照）沒有出現(xiàn)陽性說明沒有非特異性的蛋白，當(dāng)對照出現(xiàn)陽性，說明抗體有非特異結(jié)合的可能。 04 免疫共沉淀中ProteinA/G瓊脂糖珠有何作用？ ProteinA/G能特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC片段，因此能和抗體結(jié)合，而抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合，目標(biāo)蛋白和相互作用的蛋白結(jié)合。 05 Co-IP實驗中如何去除重鏈輕鏈的影響？ 1. 靶標(biāo)蛋白與抗體重鏈（55kD)、輕鏈(25kD)分子量差別很大 ; 2. IP抗體：將IP抗體固定于磁珠上 ; 3. WB抗體：IP捕獲抗體（如鼠源）與WB檢測一抗（如兔源）選用不同種屬來源的抗體（初級方案）； 4. 特殊二抗：傳統(tǒng)二抗可識別變性的重輕鏈， 而 Protein A/G-HRP 二抗僅結(jié)合完整的IgG。 06 Co-IP實驗兩個抗體需要不同種源嗎? 最好選擇兩個不同種源的抗體。選擇同一種源的抗體的問題在于：在WB之前進(jìn)行的蛋白變性這一步，由于加樣緩沖液中含有巰基乙醇，巰基乙醇會把抗體的重鏈和輕鏈間的二硫鍵破壞, 從而使抗體變成重鏈分子55KD和輕鏈分子25KD， 如果目的蛋白在55KD或25KD附近，則IP抗體的重鏈或輕鏈和目的蛋白會重疊在一起，無法分辨。 07 進(jìn)行IP反應(yīng)時，抗體、磁珠的加樣和反應(yīng)順序會對最終結(jié)果有影響嗎？ 一般有三種反應(yīng)順序： 1.樣本+抗體先反應(yīng)，然后加磁珠； 2.抗體+磁珠先反應(yīng)，然后放入樣本中； 3.樣本+抗體+磁珠同時反應(yīng)。 推薦使用第一種和第二種，差別不大。不推薦用第三種，第三種方式雖然可以減少反應(yīng)時間，但有實驗表明同時加入三個組分的方式會使最終的結(jié)果變差。  Trouble shooting 高背景 制備樣品中可能有不完全溶解的大的蛋白復(fù)合體 ? 制備樣品后進(jìn)行短暫超聲處理（3次，每次5秒鐘），然后離心純化，取上清后進(jìn)行后續(xù)試驗 洗滌不徹底 ? 多次洗滌，并逐漸增加洗滌緩沖液中的NaCl和去垢劑濃度 非特異性蛋白吸附于珠子上 ? 進(jìn)行Preclearing以排除非特異性吸附 抗體本身特異性不好 ? 選擇合適的抗體，可以考慮單抗 使用了太多的抗體 ? 進(jìn)行條件優(yōu)化減少抗體 使用了過多的細(xì)胞或組織進(jìn)行裂解 ? 減少樣本量，我們推薦100-500μg細(xì)胞裂解物 抗原降解 ? 保證樣品中加入了蛋白酶/磷酸酶抑制劑，盡量使用新鮮制備的樣品 WB步驟 ? 使用規(guī)范的WB,注意封閉、一二抗稀釋的條件 無信號 目的蛋白在樣本中表達(dá)量低或者不表達(dá) ? 首先對目的蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測，或者加大IP中加入的蛋白裂解物并進(jìn)行預(yù)處理。 ? 胞內(nèi)蛋白互作的水平較低或沒有互作，增加蛋白裂解物或進(jìn)行誘導(dǎo)處理。 細(xì)胞裂解液使用不當(dāng) ? 根據(jù)實驗需要選擇，慎重考慮。 目的蛋白未被洗脫 ? 保證使用合適的洗脫液，保證洗脫液的強(qiáng)度和pH值合適。 抗體沒有很好的與珠子相互結(jié)合 ? 選擇合適的珠子。 抗體選擇不當(dāng)或者不工作 ? 利用WB對抗體進(jìn)行驗證 抗體使用不足 ? 查閱文獻(xiàn)或者說明書，并多次優(yōu)化或選擇合適的抗體使用量。 |
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