Co-IP是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，可以確定在生理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)相互作用的蛋白質(zhì)。在蛋白復(fù)合物的研究中，不僅可以用于驗(yàn)證其存在，還可以發(fā)現(xiàn)新的蛋白符合物。

Co-IP的原理及操作

當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。假如細(xì)胞內(nèi)存在XY蛋白復(fù)合物，用X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也被沉淀下來。沉淀經(jīng)多次洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸后離心收集上清，對(duì)上清進(jìn)行免疫印跡（Western blot，WB）檢測(cè)Y蛋白的存在，如果Y出現(xiàn)，則說明蛋白X與蛋白Y存在相互作用。

如果Co-IP實(shí)驗(yàn)的目的為驗(yàn)證兩個(gè)已知蛋白之間的相互作用，則也可以分別給兩個(gè)已知蛋白融合特定的標(biāo)簽，利用標(biāo)簽抗體實(shí)現(xiàn)蛋白的沉淀及沉淀復(fù)合物中目的蛋白的檢測(cè)。例如，分別使蛋白X及蛋白Y融合HA、c-Myc標(biāo)簽，利用HA標(biāo)簽的特異性抗體沉淀HA-X融合蛋白，隨后利用c-Myc標(biāo)簽的特異性抗體對(duì)沉淀下來的復(fù)合物進(jìn)行c-Myc標(biāo)簽的檢測(cè)，如果存在c-Myc標(biāo)簽，則說明蛋白X與蛋白Y存在相互作用。

Co-IP實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)置

為了確保最終得到的結(jié)果是天然狀態(tài)下的相互作用，而不是由于某些方面造成的人工相互作用（也就是“假陽性”），在Co-IP的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過程中，需要設(shè)置正確的對(duì)照。

假設(shè)Co-IP實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組為“磁珠+抗X抗體+靶蛋白X+目的蛋白Y”，則可能出現(xiàn)的“假陽性”及對(duì)應(yīng)需要設(shè)置的實(shí)驗(yàn)對(duì)照如下表所示：

上述為了避免出現(xiàn)“假陽性”的對(duì)照稱為陰性對(duì)照，除此之外Co-IP實(shí)驗(yàn)還會(huì)設(shè)置一個(gè)陽性對(duì)照組（Input組），Input組為直接利用抗體X（抗體Y）對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行WB檢測(cè)，驗(yàn)證細(xì)胞裂解液中存在蛋白X（抗體Y）。

在某些Co-IP實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)人員會(huì)把IP后的上清分別進(jìn)行蛋白X和蛋白Y的WB檢測(cè)，該對(duì)照組稱為output組。

利用內(nèi)源性Co-IP實(shí)驗(yàn)為驗(yàn)證兩個(gè)蛋白是否存在已知作用，如果最終的結(jié)果為陽性，則可以證明兩個(gè)蛋白之間存在相互作用；但如果結(jié)果為陰性，無法證明兩個(gè)蛋白之間不存在相互作用，也有可能是蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量低等原因?qū)е隆Ｒ虼嗽谶M(jìn)行內(nèi)源性Co-IP驗(yàn)證兩個(gè)蛋白是否存在相互作用時(shí)，建議先做過表達(dá)Co-IP作為對(duì)照。

Co-IP抗體的選擇

在進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn)前，需要確認(rèn)抗體可以用于Co-IP實(shí)驗(yàn)。在Co-IP實(shí)驗(yàn)中，抗體需要識(shí)別蛋白的構(gòu)象表位，只能識(shí)別線性表位的抗體可能無法將靶蛋白沉淀出來，因此并不是所有的抗體都可以用于Co-IP實(shí)驗(yàn)。另外，用于IP靶蛋白的抗體與用于Weatern Blot檢測(cè)目的蛋白的抗體最好是不同種屬的，以避免抗體污染。（為什么最好是不同種屬？）

Co-IP瓊脂糖及磁珠的選擇

瓊脂糖與磁珠都可以作為Co-IP實(shí)驗(yàn)中的固定相將“抗體-靶蛋白-目的蛋白”復(fù)合物從細(xì)胞裂解液中分離出來。相較于瓊脂糖，磁珠具有較高的易用性及較低的非特異性結(jié)合，是更加優(yōu)質(zhì)的選擇。

Co-IP結(jié)果驗(yàn)證

目的蛋白為已知蛋白

目的蛋白為已知蛋白，Co-IP實(shí)驗(yàn)可以驗(yàn)證兩個(gè)已知蛋白是否存在相互作用或者驗(yàn)證細(xì)胞中是否存在該目的蛋白。制備或得到已知蛋白的特異性抗體，利用特異性抗體對(duì)IP得到的沉淀復(fù)合物進(jìn)行

目的蛋白為未知蛋白

目的蛋白為未知蛋白，Co-IP的目的為在細(xì)胞裂解液中尋找與已知蛋白相互作用的未知蛋白。由于目的蛋白為未知蛋白，無法得到特異性抗體，因此無法進(jìn)行WB檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。此時(shí)需要對(duì)IP得到的沉淀進(jìn)行質(zhì)譜分析，將質(zhì)譜分析得到的結(jié)果進(jìn)一步進(jìn)行已知蛋白與已知蛋白的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

Co-IP與免疫沉淀（IP）實(shí)驗(yàn)的區(qū)別

免疫沉淀

免疫沉淀是用于抗原檢測(cè)和純化的最廣泛使用的方法之一。免疫沉淀（IP）的原理為：針對(duì)特定靶蛋白的抗體與樣品（細(xì)胞裂解物等）中的靶蛋白形成免疫復(fù)合物，隨后利用Protein A-磁珠或Protein G-磁珠將該免疫復(fù)合物從混合物中沉淀下來。最后將靶蛋白從磁珠上洗脫（如果抗體沒有共價(jià)連接到磁珠上或使用變性緩沖液進(jìn)行洗脫，抗體也會(huì)被洗脫下來），并通過SDS-PAGE，Western Blot等手段對(duì)洗脫下來的蛋白進(jìn)行分析。

Co-IP

Co-IP是免疫沉淀的延伸，主要用于蛋白-蛋白相互作用檢測(cè)。Co-IP的原理是基于IP反應(yīng)捕獲和純化靶蛋白，如果樣品溶液中存在與靶蛋白相互作用的目的蛋白，也會(huì)被一同捕獲及純化得到，隨后利用SDS-PAGE，Western Blot等手段對(duì)得到的目標(biāo)蛋白進(jìn)行分析（查看詳細(xì)Co-IP實(shí)驗(yàn)原理）。

通常，判斷一個(gè)實(shí)驗(yàn)是IP實(shí)驗(yàn)還是Co-IP實(shí)驗(yàn)，只需判斷實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)是靶蛋白（IP沉淀下來的蛋白）還是目標(biāo)蛋白（相互作用蛋白）。