第一步：了解免疫沉淀是什么？我為什么要做免疫沉淀呢？

免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）是利用抗原抗體特異性反應(yīng)，從特定混合物（通常是細(xì)胞裂解液或表達(dá)上清）中純化富集目的蛋白的一種方法。傳統(tǒng)的IP實(shí)驗(yàn)是抗體與目的蛋白結(jié)合后，再與蛋白Protein A /G（結(jié)合抗體Fc片段）偶聯(lián)的瓊脂糖或磁珠孵育，通過(guò)離心得到珠子-蛋白A/G-抗體-目的蛋白復(fù)合物，復(fù)合物經(jīng)過(guò)洗滌、洗脫后用于后續(xù)下游實(shí)驗(yàn)。IP是許多蛋白質(zhì)相關(guān)研究的重要步驟，用于研究蛋白質(zhì)的存在、相對(duì)豐度、蛋白表達(dá)的上下調(diào)、蛋白至穩(wěn)定性及相互作用等。 

（傳統(tǒng)IP原理圖）

總結(jié)：

 IP的整個(gè)過(guò)程我需要用到的關(guān)鍵工具有：

一抗：選擇能與我的樣本發(fā)生反應(yīng)，能做IP實(shí)驗(yàn)的一抗；

Potein A，Potein G或Protein A /G：Potein A，Potein G及Protein A /G與不同來(lái)源及亞型的免疫球蛋白結(jié)合能力不一樣，如何選擇？請(qǐng)參考https://www./affinity-of-protein-a-protein-g-and-protein-ag/

第二步：發(fā)現(xiàn)竟然沒(méi)有合適的一抗來(lái)滿足我需要做的免疫沉淀？ 

某些目的蛋白因?yàn)闆](méi)有對(duì)應(yīng)的特異性抗體而無(wú)法進(jìn)行免疫沉淀，如抗體所識(shí)別的抗原表位被相互作用蛋白所遮蔽，無(wú)法與目的蛋白相互作用或抗體選擇不合適，所選抗體不能識(shí)別處于天然構(gòu)象的蛋白等，可以采用一個(gè)表位標(biāo)記蛋白后，再選擇針對(duì)此表位的標(biāo)簽抗體來(lái)進(jìn)行免疫沉淀。廠家會(huì)推出一些常見(jiàn)的標(biāo)簽抗體用于IP實(shí)驗(yàn)，涉及flag、HA、His、Myc等標(biāo)簽，以滿足大多數(shù)客戶的需求。

特別是瓊脂糖/磁珠偶聯(lián)的標(biāo)簽抗體，能最大限度優(yōu)化免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，節(jié)省時(shí)間和成本。

1）原理：省去了Protein A/G與抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合的步驟，且解決了Protein A/G和抗體結(jié)合能力弱的問(wèn)題。偶聯(lián)抗體直接和目標(biāo)蛋白結(jié)合后，通過(guò)離心或使用磁力架，將目標(biāo)蛋白從細(xì)胞裂解液中分離出來(lái)。高特異性單克隆標(biāo)簽抗體可實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量和高純度，穩(wěn)定、預(yù)封閉的填料及特異性抗體減少了免疫沉淀過(guò)程中的非特異性結(jié)合。

（瓊脂糖/磁珠偶聯(lián)的標(biāo)簽抗體應(yīng)用于IP）

第三步：免疫沉淀后WB (IP-WB)出現(xiàn)重鏈、輕鏈干擾，怎么辦？ 

在免疫沉淀實(shí)驗(yàn)后的WB驗(yàn)證環(huán)節(jié)中，當(dāng)使用常規(guī)的 Anti-IgG (H+L) 酶標(biāo)二抗時(shí)，通常會(huì)出現(xiàn)對(duì)應(yīng)免疫沉淀一抗變性后產(chǎn)生的重鏈（50kDa）和輕鏈（25kDa）兩條帶。如果檢測(cè)的目的蛋白分子量在此附近時(shí)，就會(huì)受到這兩條帶的干擾。如何避免干擾，

方法一：選擇只和重鏈或輕鏈反應(yīng)的二抗。如果目標(biāo)蛋白分子量小于30KD，為了避免抗體輕鏈的干擾，選擇重鏈特異性二抗；如果目標(biāo)蛋白分子量大于30KD，為了避免抗體重鏈的干擾，選擇輕鏈特異性二抗；   

方法二：選擇WB一抗時(shí)，選擇和IP用一抗不同的種屬，避免IP一抗的干擾；

方法三：選擇HRP直接偶聯(lián)的WB一抗，省去二抗的步驟。

免疫沉淀三步擊破，你掌握了嗎？