?自噬（autophagy）被認(rèn)為是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵過(guò)程，也是對(duì)等壓力源的反應(yīng)，如營(yíng)養(yǎng)缺乏，這可能會(huì)危及細(xì)胞的生存。當(dāng)細(xì)胞接觸到這些壓力源時(shí)，原本在低水平發(fā)生以平衡生物分子的恒定合成的自噬，就會(huì)被大幅度上調(diào)。 這種上調(diào)會(huì)增加了細(xì)胞的吸收和降解，將大分子釋放回胞質(zhì)中以驅(qū)動(dòng)必須的代謝反應(yīng)并產(chǎn)生能量。

在正常和壓力條件下，自噬對(duì)細(xì)胞健康的貢獻(xiàn)，意味著這種嚴(yán)格調(diào)控和精確協(xié)調(diào)過(guò)程的重要生理和病理作用。事實(shí)上， 自噬在哺乳動(dòng)物的發(fā)育過(guò)程中被發(fā)現(xiàn)是有用的。此外，最近的研究發(fā)現(xiàn)自噬是各種疾病和病癥的重要調(diào)節(jié)器。探索自噬在發(fā)育和疾病中的參與，對(duì)于更全面地了解這一途徑的作用至關(guān)重要，并且可能對(duì)保持健康或治療疾病有影響。

自噬的研究已經(jīng)成為如今醫(yī)學(xué)研究的?？?，發(fā)文量也十分巨大，成為常規(guī)生物學(xué)現(xiàn)象來(lái)研究，但是有一些實(shí)驗(yàn)上的技巧值得探討一二，例如一些試劑的使用等等

1、自噬相關(guān)試劑的使用。

①M(fèi)DC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其濃度為50 mmol/L,分裝后-20冰箱保存。臨用前用MEM稀釋到終濃度50 umol/L;

②Rapamycin:用MEM培養(yǎng)基配成終濃度為1 umol/L,現(xiàn)用現(xiàn)配;

400ng/ml喹乙醇:稱取4 mg喹乙醇,DMSO預(yù)溶(體積<0.1%)后加入10 ml MEM培養(yǎng)液至完全溶解,現(xiàn)用現(xiàn)配,避光保存;

③3-MA:首先用PBS溶解粉末,臨用前加熱至完全溶解后再加入MEM培養(yǎng)基至終濃度10mmol/L;PI3K抑制劑（3-MA，Wortmannin）可干擾或阻斷自噬體的形成；

用RAPAMYCIN誘導(dǎo)自噬我也查過(guò)一部分文獻(xiàn)，有用無(wú)血清的，也有用，一般培養(yǎng)基的，濃度從25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培養(yǎng)基中，目的是排除無(wú)血清所誘導(dǎo)出來(lái)的自噬。

文獻(xiàn)說(shuō)饑餓初期激活的是大分子自噬，在4-6小時(shí)活力達(dá)到最大，24h后以CMA途徑為主

④Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h

sigma的EBSS，貨號(hào)E2888，有碳酸氫鈉，有酚紅的，酚紅到不是很必須，只是一個(gè)PH指示作用，好看些

⑤無(wú)血清誘導(dǎo)自噬：EBSS 誘導(dǎo)6個(gè)小時(shí)就可以了。

EBSS一定可以誘導(dǎo)出來(lái)，只是需要說(shuō)明的是時(shí)間點(diǎn)的設(shè)置，因?yàn)閺酿囸I誘導(dǎo)開(kāi)始半個(gè)小時(shí)就可能開(kāi)始自噬了，一直到24小時(shí)都持續(xù)，所以應(yīng)該設(shè)置不同的時(shí)間點(diǎn)觀察這個(gè)作用。另外一個(gè)很大的問(wèn)題是，饑餓誘導(dǎo)的一個(gè)很大的弊端是細(xì)胞死亡，這也是我面臨的問(wèn)題，就是在細(xì)胞收養(yǎng)的時(shí)候蛋白濃度太小了。24小時(shí)就很少了，更不要說(shuō)48小時(shí)和72小時(shí)了。

⑥Hank's誘導(dǎo)，也就是通常所說(shuō)的饑餓誘導(dǎo)，細(xì)胞培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后以Hank's替代常規(guī)完全培養(yǎng)基，3h后就可誘導(dǎo)出自噬。我用Hank's誘導(dǎo)了3h后電鏡觀察有30%細(xì)胞都有自噬這種現(xiàn)象，但不如國(guó)外報(bào)道的高。

⑦sigma的氯喹的貨號(hào)C6628。用氯喹做自噬抑制劑，293T細(xì)胞50uM就可以。1. 可以用雙蒸水配制2. 配制后4度保存

不同的自噬抑制劑機(jī)制不同。抑制的步驟也不同。有的不能抑制lc3的剪切，但能抑制后續(xù)的步驟，Chloroquine抑制自噬體與溶酶體的融合過(guò)程，autophgy不能完成，所以lc3才會(huì)累積。 因此加了抑制劑lc3之后會(huì)比不加的要高。氯喹能提高溶酶體中的pH值，使溶酶體中的酸性水解酶喪失活性，從而導(dǎo)致“自噬溶酶體”不能降解，因此，位于自噬體和自噬溶酶體膜上的LC3不能按時(shí)降解，表現(xiàn)為L(zhǎng)C3熒光長(zhǎng)時(shí)間的保留或WB中LC3條帶變粗。

⑧Z-VAD-FMK（caspase-3 抑制劑）抑制EV71感染所引起的細(xì)胞凋亡，觀察細(xì)胞的自噬情況。研究發(fā)現(xiàn)，抑制細(xì)胞凋亡能增加LC3-I轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-II以及p62的降解。

1. 雷帕霉素：作為以mTOR 為靶點(diǎn)最經(jīng)典的誘導(dǎo)劑已經(jīng)被廣為應(yīng)用，推薦工作濃度為1μmol-10μmol；

2. 氯喹：氯喹（Chloroquine）作為溶酶體的抑制劑，可以抑制自噬體與溶酶體的融合從而可以用來(lái)作為自噬以及自噬流的抑制劑用于實(shí)驗(yàn)研究，推薦使用濃度：10umol-50umol。

2、自噬誘導(dǎo)劑

正常培養(yǎng)的細(xì)胞自噬活性很低，不適于觀察，因此，必須對(duì)自噬進(jìn)行人工干預(yù)和調(diào)節(jié)，經(jīng)報(bào)道的藥物有：

(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

(2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶）

(3) Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓

(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑

(5) Rapamycin：mTOR抑制劑

(6) Xestospongin B/