蛋白水解酶廣泛用于細(xì)胞解離。對(duì)于某些組織，木瓜蛋白酶已證明比其他蛋白酶的破壞性更小且更有效。Lam 發(fā)現(xiàn)，在用于分離龜視網(wǎng)膜的酶中，木瓜蛋白酶產(chǎn)生的創(chuàng)傷最小。用木瓜蛋白酶從成年蠑螈視網(wǎng)膜中分離出完整的單個(gè)感光細(xì)胞。Huettner 和 Baughman 描述了一種使用木瓜蛋白酶從產(chǎn)后大鼠身上獲得高產(chǎn)量、形態(tài)完整的皮質(zhì)神經(jīng)元的方法。Finkbeiner 和 Stevens 將 Huettner 和 Baughman 方法應(yīng)用于產(chǎn)后大鼠海馬的解離。木瓜蛋白酶與胎兒和出生后的大腦區(qū)域一起使用，以提供神經(jīng)元的最大解離和活力。

Worthington Papain Dissociation System 是一套試劑，旨在用于 Huettner 和 Baughman 的組織解離方法。這些材料是為了方便和簡單而設(shè)計(jì)的，對(duì)偶爾使用的用戶以及更有經(jīng)驗(yàn)和經(jīng)常使用的用戶都很有用。每個(gè)批次都經(jīng)過組織解離性能測(cè)試，并為每次解離提供新鮮制備的酶溶液。

試劑在正常運(yùn)輸過程中的預(yù)期時(shí)間內(nèi)在環(huán)境溫度下是穩(wěn)定的，但包裝應(yīng)在到達(dá)時(shí)冷藏，并在使用前可在 4-8°C 下儲(chǔ)存長達(dá)四個(gè)月。

Worthington木瓜蛋白酶解離系統(tǒng)內(nèi)容：

該包裝包含足夠的材料，可用于解離五個(gè)單獨(dú)的組織等分試樣，每個(gè)試樣最多 0.3 - 0.4 cm3。對(duì)于較大的組織樣本，在每個(gè)步驟中按比例準(zhǔn)備較大體積的試劑，并按照協(xié)議中所述的相同比例將它們組合起來。

小瓶 1

含有碳酸氫鹽和酚紅的無菌厄爾平衡鹽溶液 (EBSS)，每包一瓶。

該小瓶的等分試樣用于重構(gòu)其他小瓶并制備稀釋的抑制劑溶液。在使用之間冷藏并在每次使用前用無菌 O 2 :CO 2平衡。

小瓶 2

木瓜蛋白酶含有 L-半胱氨酸和 EDTA，每個(gè)包裝五個(gè)一次性小瓶。

該材料經(jīng)過 0.22 微米膜過濾并在高壓滅菌小瓶中凍干。用 5 毫升 EBSS（1 號(hào)小瓶）重新配制的小瓶在 1 毫摩爾 L-半胱氨酸和 0.5 毫摩爾 EDTA 中產(chǎn)生每毫升 20 單位木瓜蛋白酶的溶液。需要短暫溫育以確保完全溶解和活性。

小瓶 3

脫氧核糖核酸酶 I (DNase)，每個(gè)包裝五個(gè)一次性小瓶。

該材料經(jīng)過 0.22 微米膜過濾并在高壓滅菌小瓶中凍干。用 0.5 ml EBSS（小瓶 1）復(fù)溶的小瓶產(chǎn)生每毫升 2000 單位脫氧核糖核酸酶的溶液。避免劇烈混合。

小瓶 4

含有牛血清白蛋白的卵類粘蛋白蛋白酶抑制劑，每包一瓶。

該材料經(jīng)過 0.22 微米膜過濾并在高壓滅菌小瓶中凍干。用 32 ml EBSS（小瓶 1）復(fù)溶的小瓶產(chǎn)生的溶液的有效濃度為每 ml 10 mg 卵類粘蛋白抑制劑和 10 mg 白蛋白。內(nèi)膠塞可在復(fù)原后丟棄。該小瓶的等分試樣用于每次解離。 在使用之間冷藏并在每次使用前用無菌 O 2 :CO 2平衡。在 4°C 儲(chǔ)存時(shí)，重構(gòu)后穩(wěn)定。

還包括一張將顏色與 pH 值關(guān)聯(lián)起來的卡片，用作 O 2 :CO 2平衡的指南。

Worthington 木瓜蛋白酶解離系統(tǒng)程序：

簡而言之，該程序如下：解離介質(zhì)的組分如前所述重構(gòu)；加入切碎的組織并用O 2 :CO 2平衡混合物。通過在 37°C 下與活化的木瓜蛋白酶一起孵育，然后研磨，使組織解離。分離的細(xì)胞被沉淀，然后重新懸浮在含有卵粘蛋白（一種木瓜蛋白酶抑制劑）的培養(yǎng)基中。通過單步不連續(xù)密度梯度離心將完整細(xì)胞與細(xì)胞膜分離，最終將沉淀重新懸浮在適合細(xì)胞培養(yǎng)或流式細(xì)胞儀分析的培養(yǎng)基中。

對(duì)于那些不熟悉組織解離和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的人來說，兩個(gè)操作值得額外解釋。

1. 用 95% O 2 :5%CO 2

進(jìn)行平衡對(duì)于解離過程中組織的存活來說，培養(yǎng)介質(zhì)在生理 pH 值下充分氧化和緩沖是很重要的。當(dāng)培養(yǎng)基用 95% O 2 :5%CO 2平衡時(shí)，這兩個(gè)要求都得到了滿足。Earle 的平衡鹽溶液含有一種 pH 敏感指示染料。當(dāng)它呈紅色或紫色時(shí)，介質(zhì)太堿性。當(dāng)將組織置于木瓜蛋白酶溶液中時(shí)（步驟#4）很可能會(huì)出現(xiàn)這種情況，并且在 37°C 孵育之前通常需要用 O 2 :CO 2重新平衡。

氣體不應(yīng)直接鼓入任何含有蛋白質(zhì)的溶液中。這會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)起泡和變性，失去生物活性。氣體可以通過無菌纖維塞（例如無菌巴斯德或容量移液管中的棉塞）進(jìn)行消毒。在混合溶液的同時(shí)，將 O 2 :CO 2 連續(xù)通過液體上方的空間，直到根據(jù)試劑盒中包含的顏色表顏色指示 pH 7.2-7.4。Earle 平衡鹽溶液經(jīng)過預(yù)充氣，但每次打開瓶子時(shí)都應(yīng)使用無菌 O 2 :CO 2進(jìn)行平衡。重構(gòu)的抑制劑也應(yīng)與無菌 O 2 :CO 2平衡每次使用前。

2. 研磨（通過溫和的泵送作用分散細(xì)胞）。

這是一個(gè)關(guān)鍵的程序。它用于在解離混合物中孵育后分解組織碎片。如果用力過猛，細(xì)胞會(huì)被破壞；太弱，組織碎片將保持完整。在神經(jīng)元組織的情況下，使用 10 ml 移液器輕輕研磨，構(gòu)成以每秒約 5 ml 的速率填充和排空桶。避免使細(xì)胞懸液起泡。