胰腺癌（PDAC）的腫瘤發(fā)生依賴于KRAS和自噬，但是KRAS在自噬方面的作用仍然未知，這篇研究表明KRAS的抑制和ERK MAPK的藥理抑制增加了自噬通量,而且削弱了糖酵解和線粒體功能。作者設(shè)想抑制ERK可以增強(qiáng)PDAC對(duì)自噬的依賴，這可能是通過(guò)損害KRAS或ERK驅(qū)動(dòng)的代謝過(guò)程。他們發(fā)現(xiàn)自噬抑制劑和特異性自噬調(diào)節(jié)因子的遺傳或者藥理學(xué)抑制，協(xié)同增強(qiáng)了ERK抑制劑介導(dǎo)KRAS驅(qū)動(dòng)的PDAC中抗腫瘤的能力。最終結(jié)論：ERK MAPK（或者ERK）和自噬過(guò)程的藥物抑制劑組合可能是治療PDAC的有效方法。

KRAS突變是胰腺癌（PDAC）發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵遺傳驅(qū)動(dòng)，并且是維持PDAC腫瘤生長(zhǎng)的必要條件。鑒于95%的PDAC都有KRAS驅(qū)動(dòng)突變，美國(guó)國(guó)家癌癥研究所已經(jīng)將抗KRAS療法確定為胰腺癌研究的4個(gè)優(yōu)先事項(xiàng)之一。KRAS突變的PDAC的特點(diǎn)是發(fā)生多種代謝改變，包括糖酵解、谷氨酰胺降解、自噬依賴性增加?，F(xiàn)在KRAS抗體藥物至少有5個(gè)主要的方向。很有前景的方案是針對(duì)調(diào)節(jié)KRAS依賴代謝功能，這些功能支持PDAC發(fā)生發(fā)展的能量需求。其中一個(gè)是自噬和噬菌體調(diào)節(jié)的過(guò)程，即細(xì)胞降解細(xì)胞器、大分子和細(xì)胞廢物循環(huán)利用，由此產(chǎn)生的分解產(chǎn)物作為生物能中間體，以維持代謝需求。因?yàn)樽允稍?/span>KRAS突變的PDAC中上調(diào)，并且對(duì)腫瘤生長(zhǎng)很重要，所以自噬抑制劑羥氯喹正在接受臨床評(píng)估。羥氯喹作為單藥治療是很有限的，但是和紫杉醇聯(lián)合治療很有前景。這篇研究提供了一個(gè)新的治療策略：RAF-MEK-ERK級(jí)聯(lián)抑制劑破壞KRAS驅(qū)動(dòng)的代謝過(guò)程，促使PDAC嚴(yán)重依賴自噬，從而增強(qiáng)羥基氯喹對(duì)自噬的抑制性。

在KRAS突變的人胰腺癌細(xì)胞系中，基本自噬水平非常高。為了確定KRA S突變對(duì)維持高水平的自噬是否是必須的，作者利用3種技術(shù)來(lái)研究KRAS急性抑制對(duì)自噬通量的影響。作者首先評(píng)估了穩(wěn)定表達(dá)串聯(lián)熒光報(bào)告基因mCherry-EGFP-LC3B的PDAC細(xì)胞株的自噬通量。LC3B是自噬相關(guān)蛋白，它經(jīng)過(guò)翻譯后修飾，使其脂化并和自噬泡相關(guān)聯(lián)。利用之前研究驗(yàn)證過(guò)的寡聚siRNA來(lái)對(duì)KRAS急性抑制，發(fā)現(xiàn)6個(gè)細(xì)胞系的自噬通量增加了2到10倍（圖1a，1b）。RAS抑制劑ARS-1620處理KRAS G12C突變的MIA PaCa細(xì)胞后，自噬通量也相應(yīng)增加（圖1c）。第二，研究者通過(guò)體外表達(dá)EGFP-LC3b和體外檢測(cè)自噬體相關(guān)點(diǎn)狀形成來(lái)檢測(cè)自噬體組裝。結(jié)果表明抑制KRAS時(shí)觀察到的點(diǎn)狀增加是由于自噬通量增加，而不僅僅是穩(wěn)態(tài)變化所致。第三，研究者通過(guò)免疫印跡技術(shù)來(lái)檢測(cè)內(nèi)源性LC3B-Ⅰ向自噬體相關(guān)的脂化LC3B-Ⅱ的轉(zhuǎn)化。siRNA引起的KRAS抑制增加了LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比率，并且當(dāng)bafilomycin A1抑制自噬體降解，這增加的比例是不變的（圖1d）。因此，在KRAS突變的PDAC細(xì)胞系中，抑制KRAS增加了自噬通量，同時(shí)自噬體生成、溶酶體融合和自噬體相關(guān)LCB-Ⅱ也提高了。

圖1

作者接下來(lái)在Kras驅(qū)動(dòng)的PDAC小鼠模型（iKRAS）中進(jìn)行研究，通過(guò)模型建立的三個(gè)腫瘤細(xì)胞系中，在用藥物處理后Kras G12D被抑制（24h），自噬通量增加了7-20倍（圖1e），并且LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比例也同樣增加（圖1f）。因此在人、鼠的PDAC中，突變KRAS的抑制導(dǎo)致自噬增加而非降低。

AMPK和Beclin-1是早期自噬形成和噬菌體組裝的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子。已有研究表明KRAS沉默誘導(dǎo)自噬，研究者接下來(lái)測(cè)試KRAS變化是否影響上游自噬通路。他們發(fā)現(xiàn)shRNA介導(dǎo)KRAS的抑制增加了KRAS突變的PDAC細(xì)胞系和iKRAS細(xì)胞系中AMPK磷酸化，并且激活或增加了總Beclin-1的水平（圖1g）。另外，將10個(gè)KRAS突變PDAC細(xì)胞系進(jìn)行RNA-seq，并對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因集變異分析（GSVA）發(fā)現(xiàn)在9個(gè)細(xì)胞系中短暫的shRNA抑制KRAS和編碼自噬蛋白的基因轉(zhuǎn)錄增加有關(guān)。KRAS突變的PDAC細(xì)胞系中觀察到的自噬通量和AMPK活化增加，而在KRAS野生型PDAC細(xì)胞系BxPC-3中，抑制KRAS這兩種情況都沒(méi)有發(fā)生（圖1h，1j）。在兩種不同的胰腺細(xì)胞模型中，得出相同結(jié)論：KRAS可上調(diào)自噬，這是PDAC的關(guān)鍵生存機(jī)制。

作者發(fā)現(xiàn)ERK1/ERK2絲裂原活化蛋白激酶對(duì)KARS突變的PDAC的體內(nèi)、體外生長(zhǎng)有重要作用。為了確定這個(gè)關(guān)鍵KRAS效應(yīng)通路是否對(duì)抑制KRAS誘導(dǎo)的自噬同樣重要，作者用ERK1/ERK2選擇性抑制劑SCH772984（ERKi）處理8個(gè)PDAC細(xì)胞系（穩(wěn)定表達(dá)mCherry-EGFP-LC3B自噬報(bào)告基因）24小時(shí)，發(fā)現(xiàn)自噬通量增加了3-30倍（圖2a，2b）。ERKi處理的細(xì)胞和對(duì)照相比，LC3BⅡ/LC3BⅠ比率增加（圖2c），這也證實(shí)自噬通量增加。在iKRAS小鼠模型中，作者觀察到ERK抑制同樣使3個(gè)小鼠iKRAS PDAC細(xì)胞系的Kras G12D沉默，這導(dǎo)致自噬通量大幅度增加10-30倍（圖2d，2e）。

圖2

作者檢測(cè)了ERKi處理后AMPK和Beclin-1的活化，發(fā)現(xiàn)在抑制KRAS時(shí)，抑制ERK也導(dǎo)致人PDAC細(xì)胞中AMPK和Beclin-1磷酸化增加（圖2f）。盡管在某些細(xì)胞系中PRKAA2和BECN1轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，但ERKi處理1小時(shí)內(nèi)磷酸化的Beclin-1水平也是增加的，這表明在PDAC中KRAS通過(guò)ERK MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)節(jié)自噬。BxPC-3細(xì)胞系盡管缺乏KRAS突變，但仍有較高的自噬能力，這是由于ERK信號(hào)上調(diào)以及ERK依賴下游突變BRAF生長(zhǎng)所致。和在調(diào)節(jié)自噬中ERK信號(hào)的關(guān)鍵作用一致的是，BxPC-3細(xì)胞系經(jīng)過(guò)ERKi處理后同樣表現(xiàn)出自噬通量增加。

作者對(duì)ERKi誘導(dǎo)的自噬通量增加的基礎(chǔ)機(jī)制進(jìn)行了研究。首先對(duì)12個(gè)PDAC細(xì)胞系用ERKi或者DMSO處理1小時(shí)和24小時(shí)，然后進(jìn)行反相蛋白微陣（RPPA）分析（圖3a）。比較所有蛋白的均值后發(fā)現(xiàn)：ERK抑制的有效標(biāo)記物減少，包括ERK1/ERK2的磷酸化和活化、ERK底物RSK的磷酸化、ERK調(diào)節(jié)底物MYC總蛋白的減少。ERKi處理24小時(shí)后，凋亡介質(zhì)BIM、PUMA和caspase 7等都被上調(diào)。作者進(jìn)一步驗(yàn)證了抑制ERK可導(dǎo)致AMPKK的活化，另外還觀察到mTORC1信號(hào)的減弱（圖3a，3b）。這兩個(gè)信號(hào)通路在ERKi刺激下的改變是促進(jìn)自噬的主要機(jī)制。RPPA數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析表明磷酸化的AMPK水平和ERK抑制標(biāo)記物呈負(fù)相關(guān)，而mTOR通路中成分降低和相同標(biāo)志物呈正相關(guān)。

圖3

作者接下來(lái)利用LC-MS/MS對(duì)一組經(jīng)ERKi處理的PDAC細(xì)胞系進(jìn)行極性代謝物水平分析。和RPPA所確定的AMPK活性增加相一致，代謝組學(xué)分析也表明ERKi處理的PDAC細(xì)胞系中AMP水平有所增加，并且AMP前體IMP和AMP降解產(chǎn)物也有所增加（圖3c）這表明ERKi通過(guò)改變核苷酸代謝來(lái)增加自噬通量。此外，作者對(duì)7株ERK刺激超過(guò)24小時(shí)的人PDAC細(xì)胞系進(jìn)行了RNA-seq分析，并利用GSVA技術(shù)，確定ERKi介導(dǎo)的自噬相關(guān)基因和溶酶體基因的表達(dá)增加（圖3d，3e）。

RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)自噬的基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，但誘導(dǎo)ERK抑制的糖酵解基因轉(zhuǎn)錄本減少（圖3f）。用葡萄糖LC-MS和NMR進(jìn)行代謝通量分析來(lái)驗(yàn)證這些變化導(dǎo)致糖酵解活性下降。在用[1,6-¹³C₂]孵育細(xì)胞之前，作者用siRNA處理細(xì)胞，使KRAS基因沉默，發(fā)現(xiàn)KRAS抑制和ERK抑制降低了葡萄糖攝取。因此在ERKi處理的7株KRAS突變PDAC細(xì)胞中，關(guān)鍵糖酵解中間體明顯減少。iKRAS PDAC小鼠模型中的分析表明，突變激活的KRAS驅(qū)動(dòng)糖酵解活性，而Kras G12D的抑制降低了它的活性。作者認(rèn)為突變激活的KRAS調(diào)節(jié)了人PDAC細(xì)胞ERK抑制后有效抑制的糖酵解活性。作者假設(shè)這種ERK抑制誘導(dǎo)的糖酵解活性的降低有助于ERK抑制劑介導(dǎo)的自噬能通量的增加。當(dāng)去除PDAC細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的葡萄糖時(shí)，自噬通量增加，但幅度小于ERK抑制。因此，ERK抑制劑治療可直接和間接減少糖酵解來(lái)增加自噬通量。

RNA-seq數(shù)據(jù)顯示ERKi處理導(dǎo)致線粒體相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平降低（圖3g）。作者之前的研究表明能長(zhǎng)期存活的小鼠PDAC細(xì)胞系罕見(jiàn)亞型（<10%）更依賴于線粒體呼吸。因此，KRAS沉默或者抑制ERK降低了線粒體相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，這是出人意料的。作者首先評(píng)估了短期KRAS抑制和ERK抑制對(duì)線粒體形態(tài)和活性的影響，ERKi處理減少了線粒體數(shù)量（圖4a）。抑制ERK使有絲分裂通量增加，總PINK1水平增加。因此線粒體成分的轉(zhuǎn)錄減少，增加的有絲分裂彌補(bǔ)了線粒體數(shù)量的減少。作者發(fā)現(xiàn)ERK抑制劑處理PDAC細(xì)胞，1小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)了線粒體融合（圖4b，4c），這和DRP1(線粒體分裂中間物和ERK底物)的磷酸化水平降低有關(guān)（圖4d）。ERKi處理24小時(shí)候線粒體融合、DRP1磷酸化水平降低（圖4e，4f）。同時(shí)，DEP1總蛋白含量下降（圖4g），這和線粒體相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平下降是一致的。線粒體在ERK抑制下融合增加，這和人PDAC細(xì)胞系中KRAS短期抑制、在iKRAS小鼠模型中Kras G12D抑制的現(xiàn)象一致?？偟膩?lái)說(shuō)，ERK抑制和KRAS抑制都會(huì)導(dǎo)致線粒體網(wǎng)絡(luò)的明顯重排。

圖4

發(fā)現(xiàn)在人PDAC細(xì)胞系和iKRAS小鼠模型中線粒體融合是和線粒體活性增加有關(guān)（圖4i，4j）。在ERKi處理1.5小時(shí)后細(xì)胞耗氧率并沒(méi)有變化（圖4k），而在這個(gè)時(shí)間段線粒體融合是很強(qiáng)的。因此當(dāng)人PDAC細(xì)胞用ERKi處理24小時(shí)，基礎(chǔ)耗氧率和ATP產(chǎn)生出現(xiàn)降低或者不變的現(xiàn)象（圖4l）。在人PDAC細(xì)胞抑制KRAS、在iKRAS小鼠模型關(guān)閉Kra G12D的表達(dá)后都出現(xiàn)相似的現(xiàn)象。在Kras抑制的小鼠模型以及ERKi抑制的PDAC細(xì)胞系中備用線粒體含量小幅增加（圖4l），這和線粒體電位增加相一致。由于作者并沒(méi)有觀察到耗氧量和ATP的變化，因此這增加的電位并不是用來(lái)產(chǎn)生能量。

作者假設(shè)在抑制ERK時(shí)觀察到的自噬增加可能是PDAC細(xì)胞對(duì)自噬產(chǎn)生更強(qiáng)的依賴性。若如此，那ERK抑制和自噬同時(shí)發(fā)生應(yīng)該比單獨(dú)發(fā)生更加有效。臨床上沒(méi)有特異的自噬抑制劑，因此利用羥氯喹-溶酶體酸化的常用抑制劑-來(lái)作為自噬的間接抑制劑。作者發(fā)現(xiàn)用SCH772984（ERKi），或MEK抑制劑（MEKi）和羥氯喹同時(shí)處理可增強(qiáng)生長(zhǎng)抑制（圖5a，5b）。利用Chou-Talalay或者BLISS方法觀察到ERKi或MEKi的協(xié)同作用（圖5c）。另外，聯(lián)合處理引發(fā)的自噬量比ERKi單獨(dú)處理增加的多（圖5d）。而且當(dāng)在人胰腺受試者衍生的器官樣培養(yǎng)物上評(píng)估時(shí)，ERKi和羥氯喹之間的協(xié)同作用是不變的。（圖5e，5f）。

圖5

為了將這些體外發(fā)現(xiàn)在腫瘤內(nèi)驗(yàn)證，作者在兩個(gè)PDX小鼠模型中評(píng)估了ERKi和羥氯喹聯(lián)合作用。在兩個(gè)模型中ERKi單獨(dú)處理對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有一定的影響，但聯(lián)合處理抑制了腫瘤發(fā)生并且生存率有所提高（圖5g）。另外ERKi和羥氯喹同時(shí)處理小鼠，腫瘤大小明顯比ERKi單獨(dú)處理的?。▓D5h）。因此ERK1/ERK2和自噬的聯(lián)合抑制對(duì)抑制PDAC生長(zhǎng)更加有效。

圖6

因?yàn)榱u氯喹間接抑制自噬體，作者接下來(lái)確定自噬的特定組分的遺傳或藥理學(xué)阻斷是否也與抑制ERK發(fā)生協(xié)同作用。作者首先利用shRNA抑制自噬相關(guān)基因（ATG5和ATG7），發(fā)現(xiàn)在PDAC細(xì)胞系中，ATG5或ATG7抑制顯著增強(qiáng)了ERKi引發(fā)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制（圖6a，6d）?，F(xiàn)在已開(kāi)發(fā)出更加特異的自噬抑制化合物，包括SBI-0206965（SBI），MRT68921（MRT）和Spautin-1。SBI靶向作用ULK1，MRT靶向作用ULK1和ULK2（AMPK磷酸化的自噬預(yù)啟動(dòng)復(fù)合物的組分）。Spautin-1抑制兩種特異性肽酶USP10和USP13，它們調(diào)節(jié)Vps34復(fù)合物中Beclin-1的泛素化，從而啟動(dòng)自噬體形成。 與羥氯喹一樣，這三種自噬抑制劑都能減少PDAC細(xì)胞系的增殖（圖6e）。ATG5和ATG7基因抑制后，和三種藥理抑制劑聯(lián)合處理增強(qiáng)了ERK I介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制（圖6f，6g）。由于KRAS G12C突變體MIA-PaCa-2細(xì)胞對(duì)氯喹具有抗性，作者用ARS-1620（RASi）與SBI或MRT組合處理它們，發(fā)現(xiàn)ARS-1620誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制的協(xié)同增強(qiáng)以及聯(lián)合處理的細(xì)胞中有顯著增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡（圖6h，6i）。