植物進化出了RNA干擾（RNAi）作為抵御病毒感染的第一道防線。對于植物正義鏈(+)RNA病毒，抗病毒的RNA干擾機制和病毒的反防御機制已經(jīng)開展了廣泛的研究，但對植物負義鏈(-)RNA病毒的相關(guān)認識卻非常少。近日，我校植物保護學(xué)院陶小榮教授團隊在病毒學(xué)知名期刊《PLoS Pathogens》（IF：6.823）發(fā)表題為《Antiviral RISC mainly targets viral mRNA but not genomic RNA of tospovirus》的研究論文，該研究以番茄斑萎病毒屬病毒（Tospovirus）作為植物負義鏈RNA病毒的研究模式，發(fā)現(xiàn)抗病毒RISC復(fù)合體主要降解Tospovirus的mRNA，而病毒的基因組RNA受到核糖核蛋白復(fù)合體RNP的防護而免受RISC的降解。鑒于所有負鏈病毒的基因組RNA都形成RNP復(fù)合體，因此，本研究的發(fā)現(xiàn)可適用于所有的負鏈RNA病毒。

病毒感染寄主植物后，RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC) 被激活，該復(fù)合體在siRNA的指導(dǎo)下特異性地切割侵入細胞的病毒基因組RNA。與植物正義鏈ss(+)RNA 病毒不同，植物負義鏈(-) RNA病毒的基因組RNA分子并不是裸露的，而是與病毒核衣殼蛋白緊密結(jié)合形成核糖核蛋白復(fù)合體(RNP)，這一復(fù)合體是負鏈RNA病毒的核心侵染單位；病毒mRNA 并不組裝成RNP。對于負義鏈(-) RNA病毒來說，將基因組RNA 組裝到RNP 中是否提供了一種新的反防御策略來對抗病毒基因沉默復(fù)合物RISC 的切割活性尚未有所研究。

番茄斑萎病毒（TSWV）是最重要的植物負義鏈RNA病毒之一，能侵染1000多種植物，對全球經(jīng)濟和園藝作物安全生產(chǎn)構(gòu)成重大威脅。研究團隊利用色譜層析技術(shù)將植物體內(nèi)抗番茄斑萎病毒RISC進行分離，體外實驗研究表明體外合成的“裸露”基因組RNA可以被RISC特異性降解，但這些基因組RNA一旦組裝成RNPs則無法被RISC特異性降解。在植物體內(nèi)，利用TRV病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生抗TSWV病毒的特異性RISC，發(fā)現(xiàn)抗病毒RISC能夠特異性攻擊病毒的mRNA，但基本上不降解病毒基因組RNA。研究人員利用同樣的技術(shù)手段探究了番茄斑萎病毒屬中另一病毒番茄環(huán)紋斑點病毒（TZSV）RNA的靶標類型。研究結(jié)果表明抗病毒RISC同樣攻擊TZSV的mRNA而并不是基因組RNA。此外，通過檢測體內(nèi)RISC降解植物正義鏈RNA病毒的代表黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）的基因組RNA，結(jié)果顯示RISC可以降解CMV的基因組RNA。以上結(jié)果表明植物抗病毒RNA沉默的核心元件——RISC復(fù)合體主要攻擊番茄斑萎病毒屬病毒的mRNA而非基因組RNA，該剪切機制不同于正義鏈的RNA病毒，如CMV。研究結(jié)果為進一步了解植物防御負鏈RNA病毒的RNA干擾機制和病毒的反防御機制提供了新的認識。

論文第一署名單位為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，植物保護學(xué)院博士生洪浩為論文第一作者，陶小榮教授為通訊作者。植物病毒研究團隊朱敏副教授、青年教師李佳博士，植保學(xué)院沈丹宇副教授和荷蘭瓦赫寧根大學(xué)Richard Kormelink副教授等人參與了該項研究。該研究得到國家自然科學(xué)杰出青年基金和國家基金重點項目的資助。

近日，我校前沿交叉研究院作物表型組學(xué)交叉研究中心周濟實驗室，在國際植物科學(xué)頂級期刊《植物生理學(xué)》（Plant Physiology，IF = 8.34）中的突破性技術(shù)、工具和資源（Breakthrough Technologies, Tools, and Resources）專欄，在線發(fā)表了最新的作物表型研究型論文——Large-scale field phenotyping using backpack LiDAR and CropQuant-3D to measure structural variation in wheat。

論文結(jié)合了背包式激光雷達、三維計算機視覺技術(shù)和開源圖像分析算法開展了大規(guī)模田間小麥表型性狀采集，建立了三維表型分析平臺CropQuant-3D，進而通過田間獲取的氮素響應(yīng)性狀來鑒選不同的氮素高效利用小麥品種。在作物研究中首次使用了背包式激光雷達在大規(guī)模田間試驗中開展表型采集技術(shù)手段，通過開源三維表型分析算法對獲取的數(shù)以億計的三維點云進行了自動化分析，量化了不同小麥品種在田間的空間形態(tài)特征和相應(yīng)的關(guān)鍵農(nóng)藝性狀，進而獲取了這些性狀與產(chǎn)量、氮肥響應(yīng)之間的聯(lián)系。本研究通過結(jié)合離散傅立葉變換（Discrete Fourier Transform）和三維空間特征轉(zhuǎn)換提出了精確測量不同小區(qū)內(nèi)作物高度、解析復(fù)雜冠層結(jié)構(gòu)的算法，通過11個小麥品種結(jié)合高中低三個施氮水平在總計近1公頃田間試驗中驗證了算法的穩(wěn)定性和魯棒性，解析了表型性狀和小麥氮素響應(yīng)、產(chǎn)量構(gòu)成因素和小區(qū)產(chǎn)量等關(guān)鍵性狀的關(guān)系。此外，研究還著重介紹了周濟實驗室自主開發(fā)的開源軟件系統(tǒng)CropQuant-3D的性狀分析算法及其延展性，通過對無人機、龍門架等不同設(shè)備獲取的三維點云數(shù)據(jù)的統(tǒng)一分析，展示了該平臺在大規(guī)模田間表型分析和開源共享等方面的巨大潛力。

隨著測序技術(shù)和基因組學(xué)的飛速發(fā)展，植物遺傳學(xué)飛速發(fā)展，基因型數(shù)據(jù)海量擴充。大規(guī)?？煽勘硇蛿?shù)據(jù)的匱乏已成為解析遺傳信息、精準育種及高效栽培管理的一大瓶頸。這對高通量、多環(huán)境、多生育期且高可靠性的表型組學(xué)研究提出了新的要求。如何結(jié)合快速發(fā)展的包括激光雷達技術(shù)在內(nèi)的多尺度遙感和智能化數(shù)據(jù)解析有望為大規(guī)模育種、栽培管理和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供重大的技術(shù)支持。本研究使用的背包激光雷達較好滿足了以上需求，且兼具易使用、易運輸和用戶友好等優(yōu)勢，克服了其他表型平臺的在多地點、大規(guī)模數(shù)據(jù)采集上的局限。自主開發(fā)的CropQuant-3D分析平臺也實現(xiàn)了在普通計算機上快速完成對約1公頃的小麥試驗的性狀提取，為表型性狀采集、鑒定這一瓶頸的提供了解決方案，也為作物研究中進一步高效挖掘作物關(guān)鍵基因提供了表型支持。

我校周濟教授為本文的通訊作者，周濟實驗室的朱宇磊碩士（工學(xué)院）為第一作者，孫港碩士（農(nóng)學(xué)院）、丁國輝博士生（農(nóng)學(xué)院）和周潔碩士等實驗室成員也參與了部分工作。我校作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室、前沿交叉研究院以及江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心同為第一通訊單位。我校丁艷鋒教授、金時超副教授也參與了本項目。此外，英國國立農(nóng)業(yè)植物研究所的劍橋作物研究中心（Cambridge Crop Research, National Institute of Agricultural Botany, NIAB）、中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心和江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所也共同參與了項目研發(fā)。

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7月22日，“作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室”的水稻抗病遺傳育種課題組在《PNAS》在線發(fā)表了題為“The effect of RNA polymerase V on 24-nt siRNA accumulation depends on DNA methylation contexts and histone modifications in rice”的研究論文（Article）。

轉(zhuǎn)基因是創(chuàng)制抗病優(yōu)異種質(zhì)，培育廣譜、高抗作物新品種的一項重要現(xiàn)代生物技術(shù)。但是外來基因的導(dǎo)入常常引起作物的基因沉默，育種家有時需要從上百個轉(zhuǎn)基因株系中認真比較，經(jīng)過多代仔細篩選，才能挑選出穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)基因作物，這極大增加了轉(zhuǎn)基因育種的工作量，延緩了培育作物新品種的周期。為了闡明水稻轉(zhuǎn)基因沉默的分子機制，縮短水稻轉(zhuǎn)基因育種年限，楊東雷課題組利用35S::OsGA2ox1轉(zhuǎn)基因沉默的基礎(chǔ)材料，采取EMS誘變的方式構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因沉默的抑制子突變體庫。從中篩選出上百個fem(five elements mountain) 突變體。本次發(fā)表的工作是關(guān)于fem3的，通過圖位克隆他們發(fā)現(xiàn)FEM3編碼DNA依賴的RNA聚合酶V（Pol V）的最大亞基。

他們發(fā)現(xiàn)Pol V, 或Pol IV, 或OsRDR2突變都造成水稻的雌雄配子不育，這表明RdDM（RNA-directed DNA methylation）這一基因沉默分子通路對于水稻的生殖發(fā)育極其重要。全基因組甲基化測序與分析發(fā)現(xiàn)，Pol V缺失后，lncRNA無法轉(zhuǎn)錄，從而造成全基因組特別是基因旁鄰區(qū)域較短轉(zhuǎn)座子上的CHH類型的DNA甲基化幾乎全部喪失。小RNA測序與分析發(fā)現(xiàn)，水稻24-nt siRNA的合成幾乎全部依賴于OsRDR2和Pol IV，但只是部分依賴于Pol V。進一步比較分析發(fā)現(xiàn)，在低CG甲基化、低CHG甲基化和高CHH甲基化的區(qū)域，24-nt siRNA合成依賴Pol V。而在高CG甲基化、高CHG甲基化和低CHH甲基化的區(qū)域，24-nt siRNA的合成不依賴于Pol V。詳細分析DNA的堿基組成發(fā)現(xiàn)，24-nt siRNA的合成依賴于Pol V的區(qū)域含有較高的AT含量，而24-nt siRNA的合成依賴于Pol V的區(qū)域含有較高的GC含量。對osdrm2和osmet1兩個突變體的甲基化組，siRNA轉(zhuǎn)錄組整合分析發(fā)現(xiàn)，在24-nt siRNA的合成依賴于Pol V的區(qū)域，CG甲基化與CHH類型的甲基化相互依賴，它們協(xié)同招募Pol IV-OsRDR2進而合成24-nt siRNA。這些24-nt siRNA的合成又反饋介導(dǎo)了DNA甲基化，形成siRNA-DNA 甲基化相互加強的閉環(huán)。

那么在24-nt siRNA的合成不依賴于Pol V的區(qū)域是什么因子招募Pol IV-OsRDR2進而合成24-nt siRNA呢？他們通過分析各種組蛋白修飾，發(fā)現(xiàn)激活型組蛋白修飾如H3K4ac, H3K9ac等在依賴于Pol V的24-nt siRNA區(qū)域富集，而抑制型組蛋白修飾H3K9me1和H3K9me2的豐度在不依賴于Pol V的24-nt siRNA區(qū)域較高。24-nt siRNA合成依賴于Pol V區(qū)域旁鄰基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于不依賴于Pol V的24-nt siRNA旁鄰基因的轉(zhuǎn)錄水平。這些研究結(jié)果說明依賴于Pol V的24-nt siRNA區(qū)域位于水稻的常染色質(zhì)，而不依賴于Pol V的24-nt siRNA區(qū)域位于水稻的異染色質(zhì)。

這項首次在水稻中進行的轉(zhuǎn)基因沉默機制的系統(tǒng)研究，對于加速培育轉(zhuǎn)基因作物提供了重要的理論指導(dǎo)。并且，這篇論文首次詳細鑒定了單子葉植物Pol V的生物學(xué)功能，闡明了水稻中Pol V差異化調(diào)節(jié)siRNA合成的分子機制，為理解水稻表觀基因組提供了新的認識。

論文第一作者單位與通訊作者單位均為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)。博士研究生鄭克志為第一作者，博士研究生王莉莉和前沿交叉研究院曾龍軍為該論文共同第一作者，楊東雷為唯一通訊作者。此外，農(nóng)學(xué)院高夕全教授和福建農(nóng)林大學(xué)郭忠新教授對該工作也有貢獻。該研究得到了國家自然基金面上項目、轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?、江蘇省自然基金杰出青年基金、“萬人計劃”－青年拔尖人才、江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心等基金的資助，高通量測序數(shù)據(jù)分析工作在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生物信息中心平臺完成。

2015年，課題組負責(zé)人楊東雷作為高層次引進人才加入南農(nóng)后，以水稻為研究作物，關(guān)注抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗病與產(chǎn)量性狀之間的互作。引進到南農(nóng)后，研究成果以通訊作者或第一作者在 Nature Plants、PNAS、Cell Research、Molecular Plant、Cell Discovery、Plant Physiology等期刊上發(fā)表8篇SCI論文。2017年獲得江蘇省杰出青年基金，2019年入選南京農(nóng)業(yè)大學(xué)鐘山學(xué)者計劃－青年學(xué)術(shù)骨干（B類）稱號, 2020年獲得中組部“萬人計劃”－青年拔尖人才資助。