【原】易基因 | 精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)：核酸療法的現(xiàn)狀｜新藥研究

深圳易基因科技 2021-07-13

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易點(diǎn)評(píng)

越來越多被批準(zhǔn)的核酸療法用臨床實(shí)踐向人們證明，通過靶向其在體內(nèi)的遺傳信息來治療疾病是擁有巨大潛力的。傳統(tǒng)療法產(chǎn)生的治療效果通常比較短暫，因?yàn)樗鼈冡槍?duì)的往往是蛋白質(zhì)，而非根本的基因問題。相比之下，核酸療法可以通過基因抑制、增添、替換或編輯來達(dá)到長期的療效。在這篇綜述中，作者論述了四種實(shí)現(xiàn)核酸藥物治療臨床轉(zhuǎn)化的平臺(tái)技術(shù)：反義寡核苷酸、配體修飾的小干擾RNA偶聯(lián)物、脂質(zhì)納米粒和腺相關(guān)病毒載體。對(duì)于每個(gè)平臺(tái)，作者討論了當(dāng)前最先進(jìn)的臨床治療方案，解釋其開發(fā)背后的原理，并提供了臨床相關(guān)基因藥物的實(shí)例。此外，作者還討論了如何應(yīng)用這些技術(shù)使尖端基因藥物的發(fā)展成為可能，如組織特異性核酸生物結(jié)合物、信使RNA和基因編輯療法等。

背景

早在半個(gè)世紀(jì)前，就有科學(xué)家曾預(yù)想出，可以通過引入功能性基因拷貝來治療由于基因功能失調(diào)的產(chǎn)物導(dǎo)致的遺傳性疾病。然而就在今天，核酸療法已經(jīng)成為全球抗擊新冠肺炎的前沿技術(shù)。

美國食品和藥物管理局(FDA)和歐洲藥品管理局(EMA)最近批準(zhǔn)了各種基于核酸的臨床療法。與傳統(tǒng)的以蛋白質(zhì)為靶點(diǎn)的藥物不同，基因藥物通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)來取得一定的治療效果。將外源核酸導(dǎo)入細(xì)胞以抵消產(chǎn)生缺陷的基因是一種十分具有吸引力的療法，可以在遺傳性和獲得性疾病中獲得高度特異且持久的治療效果。然而，使用核酸作為治療藥物是具有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀妆缓怂崦附到?，并且具有不利的物理化學(xué)特性，這會(huì)阻止其向細(xì)胞內(nèi)傳播。因此，安全有效的核酸療法需要先進(jìn)的輸送平臺(tái)技術(shù)。在這篇綜述中，作者使用'核酸療法’一詞來代表所有基于核酸的治療方法，這些方法通過在DNA或RNA水平上抑制、增添、替換或編輯來達(dá)到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的目的。

在過去的30年里，已經(jīng)產(chǎn)生了安全、有效的輸送平臺(tái)，這使核酸療法成為可能。幾種用于治療感染、癌癥、肌肉和視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良以及其他遺傳性疾病的體外和體內(nèi)遺傳藥物最近已被批準(zhǔn)(或處于后期開發(fā)階段)。已經(jīng)批準(zhǔn)的幾種體內(nèi)核酸療法如表1所示。這些療法的有效性主要取決于化學(xué)修飾和技術(shù)，這些修飾和技術(shù)旨在保護(hù)核酸不被降解，并確保它們?cè)谘h(huán)中的穩(wěn)定性，使其能夠定位到靶組織，并確保向細(xì)胞內(nèi)有效遞送。在這里，作者提供了病毒和非病毒技術(shù)的概述，這些技術(shù)促進(jìn)了體內(nèi)核酸療法的臨床轉(zhuǎn)化。絕大多數(shù)已獲批準(zhǔn)或目前處于晚期臨床評(píng)估中的核酸療法主要依賴于四種平臺(tái)技術(shù)：化學(xué)修飾的反義寡核苷酸(ASO)、N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)配體修飾的小干擾RNA(siRNA)偶聯(lián)物、脂質(zhì)納米粒(LNP)和腺相關(guān)病毒(AAV)載體(圖1)。對(duì)于每種平臺(tái)技術(shù)，作者解釋了作用模式(圖2)，提供了其開發(fā)背后的基本原理，強(qiáng)調(diào)了促進(jìn)其臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵技術(shù)層面，并以臨床相關(guān)的藥物產(chǎn)品為例討論了其治療效果和不良反應(yīng)

圖1

ASO

ASO是一種短的合成核酸，通過經(jīng)典的沃森?克里克堿基配對(duì)與細(xì)胞核糖核酸雜交來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，通過結(jié)合前信使核糖核酸或信使核糖核酸，修飾前信使核糖核酸的加工和剪接、翻譯以及靶核糖核酸的降解等機(jī)制，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成。另一種機(jī)制則是利用由RNase H1(由DNA：RNA雙鏈招募)或Argonaute 2(由RNA：RNA雙鏈通過RNA干擾途徑招募)介導(dǎo)的內(nèi)源RNA降解途徑。

潛在的脫靶性是所有核酸的治療策略的重要考慮因素。與其他核酸藥物相比，分子大小和精確的序列設(shè)計(jì)賦予了ASO特別巨大的治療潛力。例如，人工microRNA(miRNA)啟動(dòng)的基因調(diào)控依賴于目標(biāo)mRNA 3'非翻譯區(qū)和miRNA的前7到8個(gè)5’核苷酸之間的序列互補(bǔ)。而mRNA與miRNA的結(jié)合是可變的，因此單個(gè)miRNA可以與多個(gè)不同親和力的mRNA相互結(jié)合，ASO與RNA結(jié)合受到目標(biāo)RNA和整個(gè)ASO分子之間的互補(bǔ)性的嚴(yán)格調(diào)控，整個(gè)ASO分子的長度通常在13到30個(gè)核苷酸之間。這種嚴(yán)格的結(jié)合特異性與ASO的療效直接相關(guān)。

ASO的中等大小也意味著不同靶組織部位可以通過多種給藥途徑實(shí)現(xiàn)(圖2)。在體內(nèi)，未經(jīng)修飾的磷酸二酯ASO可被血清核酸酶迅速降解，并被腎臟過濾從體循環(huán)中清除。因此，ASO核苷、堿基和核苷骨架的化學(xué)修飾對(duì)于改善藥物動(dòng)力學(xué)、保持靶向親和力和有效性至關(guān)重要(圖1)。治療上有效的ASO是經(jīng)過大量修飾的，因此它們不需要遞送載體。這種在制造過程中限制下游加工的做法降低了一定的生產(chǎn)成本。

平臺(tái)技術(shù)設(shè)計(jì)。ASO首次通過翻譯抑制Rous sarcoma病毒(RSV)RNA來治療巨細(xì)胞病毒性視網(wǎng)膜炎。Vitravene(Fomivirsen)是一種以脫氧核苷酸為基礎(chǔ)的ASO，與RSV基因組RNA的末端重復(fù)區(qū)域結(jié)合。通過競爭性抑制，Vitravene直接干擾病毒基因組循環(huán)，招募RNase H1來阻斷病毒蛋白翻譯。也可以使用與內(nèi)源miRNA互補(bǔ)的ASO來間接修飾靶基因的表達(dá)。ASO還可以影響mRNA的剪接。2016年批準(zhǔn)的Exondys 51(Eteplirsen)和Spinraza(Nusinesen)可以誘導(dǎo)外顯子跳躍用于治療Duchenne肌營養(yǎng)不良癥和脊髓性肌萎縮癥(SMA)(表1)。

磷酸二酯ASO的早期研究在體外實(shí)現(xiàn)了RNA靶標(biāo)結(jié)合，但在體內(nèi)受到核酸酶降解和清除的阻礙。引入ASO主干內(nèi)的硫代磷酸鍵(即第一代ASO修飾)，以增加核酸酶抗性，降低親水性，促進(jìn)血清蛋白結(jié)合，以延長循環(huán)壽命，同時(shí)保持RNase H1活性。然而，第一代ASO具有免疫刺激作用，與未修飾的ASO相比，其靶結(jié)合親和力較低。

ASO核苷的化學(xué)修飾已取得廣泛進(jìn)展(圖1)。2'-核糖或第二代修飾包括2’-O-甲基(2'-OME)、2’-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2’-O-氨基丙基(2'-O-AP)和2’-氟。這些2'取代基影響ASO分子構(gòu)象，導(dǎo)致RNA靶標(biāo)結(jié)合親和力提高，除2’-氟外，其他取代基均會(huì)使其核酸酶抗性增強(qiáng)。雖然不太常見，但堿基修飾也可以合并到ASO設(shè)計(jì)中。在已經(jīng)確定的許多修飾中，只有用5-甲基胞嘧啶取代胞嘧啶被證明是有益的：5-甲基胞嘧啶替代在不影響沃森?克里克互補(bǔ)的情況下減少了天冬氨酸的免疫刺激效應(yīng)。第三代修飾更廣泛地改變了ASO化學(xué)性質(zhì)，以進(jìn)一步增強(qiáng)給藥后的穩(wěn)定性和效力，同時(shí)提高了對(duì)靶標(biāo)的親和力和細(xì)胞的趨向性。

單個(gè)ASO經(jīng)常合并多種修飾，以結(jié)合它們的優(yōu)點(diǎn)同時(shí)減輕相關(guān)并發(fā)癥(圖1)。例如，向完全硫代修飾的ASO主干添加第二代修飾可提高結(jié)合親和力，并保持取代基賦予的核酸酶抗性。類似地，嵌合ASO含有未修飾脫氧核苷酸的中心區(qū)，兩側(cè)是末端2'-修飾的核苷酸。脫氧核苷酸區(qū)域保留了RNase H1的活性，而外周2'-修飾提高了療效。

臨床實(shí)例。Nusinesen，市場名稱Spinraza，是一種完全硫代和2'-MOE修飾的核糖核苷酸ASO，被批準(zhǔn)用于治療SMA。SMA是一種常染色體隱性遺傳病，由存活運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元1基因(SMN1)功能缺失突變引起。SMN1突變導(dǎo)致存活運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元蛋白(SMN)缺乏，從而導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元改變。SMN1及其類似物SMN2的DNA序列都編碼SMN，但SMN2增強(qiáng)子內(nèi)的堿基替換意味著這兩個(gè)基因的主要mRNA產(chǎn)物是不同的剪接異構(gòu)體。SMN1 mRNA產(chǎn)生全長SMN，而SMN2 mRNA缺乏外顯子7，產(chǎn)生截短的、無功能的SMN。Spinraza的作用機(jī)制是利用這一效應(yīng)進(jìn)行SMA治療。ASO結(jié)合SMN2的前體mRNA，修飾剪接以促進(jìn)外顯子7的包含體，并增加SMN2 mRNA翻譯的全長SMN的比例。由于Spinraza不針對(duì)SMA的致病基因，ASO結(jié)合不依賴于SMN1突變類型，這意味著Spinraza是所有SMA患者都可行的治療選擇。

圖2

GalNAc?siRNA偶聯(lián)物

與GalNAc結(jié)合是增加siRNA在靶器官的蓄積和促進(jìn)其細(xì)胞攝取的有效途徑。在缺乏保護(hù)性傳送載體的情況下，必須對(duì)siRNA進(jìn)行化學(xué)修飾，以確保腸外給藥后循環(huán)的穩(wěn)定性。為了沉默肝細(xì)胞中的致病基因，這些療法是由連接到以去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)為靶點(diǎn)的GalNAc部分的siRNA組成的(圖1)。ASGPR能夠特異性地將碳水化合物與末端半乳糖或GalNAc殘基結(jié)合。同時(shí)ASGPR主要表達(dá)在肝細(xì)胞上，因此提供了進(jìn)入肝臟內(nèi)特定細(xì)胞類型的通道。ASGPR含量豐富(每個(gè)細(xì)胞約500,000個(gè)ASGPR)，主要表達(dá)于肝細(xì)胞竇膜上(>95%)，是一種理想的肝臟siRNA遞送受體。此外，它的高內(nèi)化和循環(huán)率(幾分鐘內(nèi))可以達(dá)到持續(xù)攝取siRNA分子，從而增加靶細(xì)胞濃度的目的。不同的物種表現(xiàn)出相同的碳水化合物識(shí)別模式，這是臨床前和轉(zhuǎn)化性研究設(shè)計(jì)中的一個(gè)重要考慮因素。

平臺(tái)設(shè)計(jì)。選擇性和高效的靶向配體、優(yōu)化的siRNA設(shè)計(jì)和有利的給藥途徑是實(shí)現(xiàn)GalNAc-siRNA臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。ASGPR是一種含糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域的多個(gè)亞基組成的異寡聚受體復(fù)合體。同時(shí)與幾個(gè)受體亞基結(jié)合的碳水化合物數(shù)量增加，親和力呈指數(shù)上升。糖類的空間排列和糖基是ASGPR特異性和高效結(jié)合的關(guān)鍵。值得注意的是，與半乳糖相比，ASGPR對(duì)GalNAc的親和力更高(最高可達(dá)100倍)。

最初為ASO療法設(shè)計(jì)的化學(xué)修飾也同樣應(yīng)用于siRNA療法(圖1)。用于siRNA的修飾包括2'-OME、2’-氟和硫代磷酸鍵，以改善代謝穩(wěn)定性，并增加與靶mRNA的結(jié)合。迭代的siRNA設(shè)計(jì)優(yōu)化使Alnylam擁有專利的ESC。ESC?GalNAc?siRNA結(jié)合物的穩(wěn)定性增強(qiáng)，大大增加了肝臟暴露，延長了基因沉默時(shí)間，使療效比標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)修飾強(qiáng)10倍。嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?/span>siRNA序列選擇，可以降低雜交依賴的脫靶效應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。更多的siRNA修飾，包括乙二醇核酸取代(ESC+)或糖醇核酸殘基，可能會(huì)在未來的復(fù)合體中實(shí)施，以進(jìn)一步提高RNAi的治療效果，減少不利影響。進(jìn)一步平衡化學(xué)修飾和與RNAi機(jī)制的兼容性將是下一代siRNA療法的關(guān)鍵。

最后，給藥途徑影響了GalNAc?siRNA偶聯(lián)物的臨床轉(zhuǎn)化，也影響了患者的依從性。由于其分子量較低，GalNAc?siRNA偶聯(lián)物易于皮下給藥(圖2)。這推遲了siRNA向肝臟的傳遞的時(shí)間，但由于ASGPR的高容量回收，仍然可以實(shí)現(xiàn)了高效和穩(wěn)定的對(duì)抗疾病。幾種GalNAc?siRNA偶聯(lián)物目前正在進(jìn)行治療心臟代謝性和遺傳性疾病的晚期臨床評(píng)估(表2)。

臨床實(shí)例。Givosiran(市場名稱為Givlaari)是美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)的一種基于GalNAc?siRNA技術(shù)的RNA干擾療法，用于治療急性肝卟啉癥，這種疾病是由于血紅素生物合成途徑相關(guān)的基因突變引起的。增加氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS1)表達(dá)的物理觸發(fā)因素會(huì)導(dǎo)致氨基乙酰丙酸(ALA)和膽紅素原(Porphobilinogen)的積聚，這是一種有毒的中間體，會(huì)損害神經(jīng)組織，導(dǎo)致急性、危及生命的嚴(yán)重腹痛、神經(jīng)病(中樞和外周)和神經(jīng)精神癥狀的發(fā)作。先前，急性肝卟啉癥的唯一治療方法是血紅素(一種外源性血紅素來源)，它被批準(zhǔn)用于治療癥狀后患者，但不是預(yù)防性治療。Givlaari則利用RNAi機(jī)制來減少和防止ALAS1表達(dá)的增加。

這項(xiàng)技術(shù)臨床轉(zhuǎn)化的一個(gè)局限是缺乏合適的診斷生物標(biāo)記物。共同開發(fā)一種基于血清和尿液中ALAS1-mRNA濃度的生物標(biāo)記物既提高了臨床診斷水平，又提供了一種有效的生物標(biāo)記物，可用于監(jiān)測(cè)治療終點(diǎn)，而不需要進(jìn)行侵入性操作（肝臟活檢）。在不同物種(即嚙齒動(dòng)物和非人類靈長類動(dòng)物)之間有一個(gè)驚人的相似之處，那就是循環(huán)RNA的存在，這種RNA與肝臟的表達(dá)密切相關(guān)。此外，患者樣本也顯示出循環(huán)中ALAS1-mRNA水平類似的升高。

表1

LNP

生物膜的通透性要求嚴(yán)重限制了大的、電荷密集的大分子(即核酸)在質(zhì)膜上的傳輸。為了克服這一點(diǎn)，費(fèi)爾納等人在陽離子脂質(zhì)方面做出了具有里程碑意義的貢獻(xiàn)。為一類新的脂質(zhì)介導(dǎo)的傳送系統(tǒng)鋪平了道路。

LNP給RNA提供一個(gè)受保護(hù)的隔間，將其與血清核酸酶和免疫成分隔離，并由載體決定藥物的生物分布情況。在這篇綜述中，作者重點(diǎn)介紹了在靜脈給藥后開發(fā)的用于肝臟siRNA傳遞的LNP技術(shù)(圖2)?？呻婋x陽離子脂質(zhì)的發(fā)現(xiàn)對(duì)于基于LNP的RNA療法的臨床轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。這些脂質(zhì)確保有效的siRNA包封率(>85%)，在生理pH下維持中性的LNP表面電荷，并在內(nèi)體逃逸中發(fā)揮重要作用。全身給藥后，載脂蛋白E(ApoE)吸附到LNP表面，并通過低密度脂蛋白受體(圖1)促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)化，使肝臟累積劑量>80%。

平臺(tái)設(shè)計(jì)。LNP體系見證了25年間從最初的僅由磷脂和膽固醇組成的配方到如今的演變。這些進(jìn)展得益于小分子療法中脂質(zhì)載體的發(fā)現(xiàn)。將這個(gè)體系轉(zhuǎn)化成可以攜帶核酸的載體需要額外的功能，比如能夠有效地捕獲，保持表面電荷中性，以及逃避免疫系統(tǒng)等。

LNP通常由四種成分組成：可電離陽離子脂類、磷脂、膽固醇和聚乙二醇(PEG)類脂(圖1)。用于肝細(xì)胞基因沉默的LNP制劑以0.095(w/w，siRNA/脂質(zhì))的比例包裹siRNA，并最終形成~50 nm的顆粒。作者討論了以下對(duì)臨床轉(zhuǎn)化至關(guān)重要的因素：可電離陽離子脂質(zhì)的優(yōu)化、可擴(kuò)散的PEG-脂質(zhì)設(shè)計(jì)、可擴(kuò)展的制造工藝。

可電離脂質(zhì)的構(gòu)成和酸離解常數(shù)的優(yōu)化極大地提高了LNP的功能，從而使臨床轉(zhuǎn)化成為可能。像DOTMA這樣的陽離子脂質(zhì)表現(xiàn)出永久毒性，阻礙了體內(nèi)的快速翻譯。合理設(shè)計(jì)和反復(fù)篩選使用FVII模型確定的DLin?MC3-DMA；它的發(fā)展已經(jīng)在其他地方進(jìn)行了回顧。優(yōu)化上一代脂質(zhì)，如DLin?DAP，將治療指數(shù)提高了8,000倍。

確定LNP?siRNA轉(zhuǎn)染能力的另一個(gè)關(guān)鍵成分是PEG-脂質(zhì)，這是在顆粒形成過程中防止聚集所必需的。然而，PEG-脂質(zhì)抑制了對(duì)靶細(xì)胞的攝取，因此對(duì)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生反作用。為了在穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染能力之間找到最佳的平衡，科學(xué)家們開發(fā)了含有C14烷基鏈的可擴(kuò)散的PEG-脂質(zhì)。這些脂類能夠迅速從LNP解離，產(chǎn)生具有轉(zhuǎn)染能力的系統(tǒng)。臨床前研究表明，含有可擴(kuò)散的PEG-脂質(zhì)的LNP在肝臟中迅速蓄積，循環(huán)半衰期不到15分鐘。

LNP?siRNA的制造需要一個(gè)快速、可重復(fù)性的過程。這是通過乙醇負(fù)載技術(shù)完成的，該技術(shù)包括在高濃度乙醇(~40% v/v)的存在下將預(yù)制的LNP(pH=4)與核酸混合。隨后開發(fā)的一種高通量快速混合過程通過T-junction將溶解于乙醇的脂質(zhì)與水緩沖液(pH=4)中的核酸結(jié)合在一起，從而將核酸有效地裝載到LNP系統(tǒng)中?？焖倩旌霞夹g(shù)制備的LNP?siRNA包封率高(>85%)，粒徑分布窄。最近的研究表明，這種結(jié)構(gòu)包括一個(gè)疏水的油核，主要由中性的可電離脂質(zhì)組成，周圍環(huán)繞著雙層排列的siRNA與脂類的絡(luò)合，每個(gè)顆粒的siRNA拷貝數(shù)不均勻。

臨床實(shí)例。Patisiran(市場名稱為Onpattro)是一種RNAi療法，依靠LNP遞送技術(shù)治療遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素淀粉樣變性(hATTR)。這種疾病是由轉(zhuǎn)甲狀腺素(TTR)基因突變引起的，這種突變使TTR蛋白異常聚集和積累。因此，這種疾病表現(xiàn)為影響許多器官系統(tǒng)的全身性病理。轉(zhuǎn)甲狀腺素在肝臟中由肝細(xì)胞表達(dá)并分泌到循環(huán)中。

Onpattro由DLin?MC3-DMA、磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG-脂質(zhì)組成，比例為50/10/38.5/1.5 mol%。與ASO Tegsedi一樣，在Onpattro開發(fā)時(shí)，肝移植是hATTR患者的唯一治療選擇。Onpattro利用LNP?siRNA在肝細(xì)胞(TTR的來源)中的高度積累和這些細(xì)胞中基因沉默的效力來抑制突變的TTR表達(dá)。通過這樣做，Onpattro極大地減少了實(shí)現(xiàn)有效基因沉默所需的核酸數(shù)量。

表2

AVV載體

自從幾十年前首次提出基因治療以來，安全有效的哺乳動(dòng)物逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒的發(fā)展對(duì)臨床轉(zhuǎn)化起到了重要作用。雖然早期的研究提供了明確的證據(jù)表明病毒載體可以成功地傳遞治療性基因，但臨床益處只在少數(shù)研究中得以體現(xiàn)，并且還會(huì)發(fā)生顯著的免疫毒性(在某些情況下導(dǎo)致患者死亡)。此外，還發(fā)現(xiàn)使用能夠整合基因組的病毒載體會(huì)引發(fā)的嚴(yán)重遺傳毒性。雖然這些研究結(jié)果引發(fā)了人們對(duì)這種病毒策略的巨大懷疑，但同時(shí)也提高了人們對(duì)媒介生物學(xué)及其與靶細(xì)胞和組織的相互作用的理解。這最終導(dǎo)致了重組病毒載體的開發(fā)和臨床轉(zhuǎn)化。目前已有明確的研究結(jié)果說明，這種載體更有效，風(fēng)險(xiǎn)更低。

病毒載體是有效的DNA傳遞載體，因?yàn)樗鼈円呀?jīng)進(jìn)化到對(duì)特定細(xì)胞類型的趨向性，并且與前述方法相比，是唯一能夠主動(dòng)將其有效物質(zhì)傳遞到細(xì)胞核的系統(tǒng)。后一個(gè)特點(diǎn)是十分重要的，因?yàn)獒槍?duì)DNA全基因編碼的治療在細(xì)胞核外是不起作用的。通常情況下，非病毒系統(tǒng)依賴于細(xì)胞分裂階段，此時(shí)核膜崩潰和重塑允許DNA被動(dòng)擴(kuò)散到細(xì)胞核中。

幾種基于重組病毒載體介導(dǎo)的基因傳遞的藥物產(chǎn)品已經(jīng)獲得FDA和EMA的批準(zhǔn)。這些治療包括體外或體內(nèi)方法，即在非腸道給藥后，基因直接傳遞到細(xì)胞，主要由AAV載體介導(dǎo)。這篇綜述討論了AAV載體介導(dǎo)的體內(nèi)療法，這些療法除了用于視網(wǎng)膜疾病外，還用于治療與肝臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病的晚期臨床評(píng)估(表1和表2)。

平臺(tái)設(shè)計(jì)。野生型AAV是一種小的、無包膜的細(xì)小病毒(~25 nm)，其基因組為~4.7kb的單鏈DNA(ssDNA)。作為運(yùn)送載體的重組AAV載體通常含有與野生型AAV相同的衣殼成分和結(jié)構(gòu)，但所有病毒編碼序列都被治療性基因取代，最大限度地增加了包裝能力，降低了免疫原性(圖1)。由于AAV的趨向性范圍很廣，AAV可用于多種組織的靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有潛在的細(xì)胞特異性。衣殼蛋白序列中的可變區(qū)定義了AAV血清型，并通過改變衣殼和受體之間的結(jié)合作用來決定嗜性，從而促進(jìn)了它們的細(xì)胞攝取。與受體結(jié)合的AAV進(jìn)入細(xì)胞，通過早期內(nèi)小體的酸化釋放到胞漿中，并在核周聚集后進(jìn)入細(xì)胞核(圖2)。

此外，AAV載體還有許多其他特點(diǎn)，使其成為治療性基因輸送的一個(gè)有吸引力的平臺(tái)。首先，AAV需要輔助病毒進(jìn)行復(fù)制，因此被認(rèn)為是非致病性的。其次，在AAV在細(xì)胞核內(nèi)脫殼后，倒置末端在載體基因組驅(qū)動(dòng)下重組，形成異體結(jié)構(gòu)?；蚪M整合發(fā)生的頻率很低，降低了遺傳毒性的可能性。第三，到目前為止，12種不同的AAV類型和數(shù)百種額外的變種意味著AAV介導(dǎo)的核酸治療具有廣泛的實(shí)用價(jià)值。然而，AAV也有幾個(gè)限制。最突出的是，AAV載體對(duì)小于5.0kb的基因的包裝能力，因此將它們的應(yīng)用限制在治療可以將基因包裝在單個(gè)載體中的疾病。為了克服這一點(diǎn)，正在開發(fā)一種方法，通過共同管理攜帶單獨(dú)(一半)基因的多個(gè)載體，來應(yīng)對(duì)更大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因或多個(gè)轉(zhuǎn)基因(用于多基因疾病的治療)。在細(xì)胞核中釋放后，單鏈DNA需要轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA，然后才能進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)。AAV最適合將DNA輸送到長壽、未分裂或緩慢分裂的細(xì)胞，如肝細(xì)胞。

臨床實(shí)例。Voretigene neparvovec-rzyl(俗稱Luxturna)是一種含人RPE65基因的AAV2載體，可用于治療遺傳性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良LCA 2型。重組載體基因組含有巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子和雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，可促進(jìn)RPE65的表達(dá)，同時(shí)載體仍保持在細(xì)胞核內(nèi)。在Luxturna開發(fā)之前，沒有藥物治療LCA 2型疾病，這是一種由RPE65基因突變引起的常染色體隱性遺傳病。雖然罕見，但這種疾病是基因治療的一個(gè)有吸引力的選擇，部分原因是它可以通過引入單一的野生型基因來治療。此外，由于眼睛是一個(gè)相對(duì)較小、容易接近的器官，治療劑量所需的載體粒子數(shù)量較少，從而降低了不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。這種簡化的通路也方便了多種給藥途徑(主要是玻璃體內(nèi)或視網(wǎng)膜下，就像Luxturna的情況一樣)(圖2)。此外，眼睛受到血液?眼屏障的免疫特權(quán)，這種屏障可以防止媒介粒子擴(kuò)散到身體的其他部位，并促進(jìn)免疫反應(yīng)。由于AAV針對(duì)的是有絲分裂后的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，預(yù)計(jì)這種治療將持續(xù)很長時(shí)間。

討論

自從半個(gè)世紀(jì)前首次提出使用基因療法治療疾病以來，重大的生物學(xué)和技術(shù)突破已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種安全、有效的平臺(tái)技術(shù)(圖3)。重要的是，目前批準(zhǔn)的和正在開發(fā)的核酸療法對(duì)于以前治療選擇有限或沒有治療選擇的患者來說往往是有價(jià)值的治療選擇。這些技術(shù)成功的臨床應(yīng)用激發(fā)了人們對(duì)提高組織特異性(例如ASO和siRNA偶聯(lián)物)和擴(kuò)大潛在應(yīng)用的極大興趣，特別是在LNP和AAV載體系統(tǒng)中。這篇綜述主要集中在已批準(zhǔn)的核酸療法上，但mRNA和基因編輯療法的發(fā)展非常迅速，這些療法已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中，甚至已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療傳染病和癌癥。

圖3

為了克服已批準(zhǔn)的ASO和siRNA治療藥物的某些局限性，已經(jīng)開發(fā)了各種生物結(jié)合方法，特別是通過調(diào)節(jié)它們的藥代動(dòng)力學(xué)以及促進(jìn)受體特異性的相互作用。與GalNAc偶聯(lián)的ASO可以通過增加靶基因在肝細(xì)胞中的積累，使靶基因在肝細(xì)胞中的沉默增加到60倍。同樣，抗體修飾的siRNA延長了GalNAc?siRNA在血清中相對(duì)較短的半衰期，從2小時(shí)左右延長到10小時(shí)以上。通過化學(xué)改造具有親脂性部分的寡核苷酸可以改變肝外組織中的蓄積，使基因在包括心臟、肺和肌肉在內(nèi)的各種組織中進(jìn)行調(diào)控。最近的一些研究表明，將化學(xué)部分(例如糖、脂類、抗體等)直接連接到ASO或siRNA上所構(gòu)成的核酸生物結(jié)合物是一類具有臨床實(shí)用價(jià)值的新興藥物(表2)。

隨著第一種RNAi藥物Onpattro的成功開發(fā)，LNP技術(shù)現(xiàn)在正在促進(jìn)mRNA應(yīng)用于蛋白質(zhì)替代療法和疫苗開發(fā)。利用有效的載脂蛋白介導(dǎo)的肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染，LNP的mRNA制劑可以將肝臟轉(zhuǎn)化為用于生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)的“生物反應(yīng)器”。同時(shí)，LNP-mRNA編碼的抗原正被用于皮下、肌肉或皮內(nèi)的免疫調(diào)控。與基于病毒或DNA的疫苗相比，mRNA有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：它是非傳染性、非整合性的，并且只需要細(xì)胞質(zhì)傳遞。兩種LNP-mRNA疫苗也在對(duì)抗SARS-CoV-23的斗爭發(fā)揮了重要的作用。

類似的方法也被用來生產(chǎn)用于癌癥免疫治療的個(gè)體化疫苗。這種方法包括對(duì)患者的正常以及腫瘤組織進(jìn)行測(cè)序，然后生產(chǎn)編碼單個(gè)癌癥特異性新表型的mRNA疫苗。這些疫苗在臨床前的癌癥模型中有很好的治療效果，目前乳腺癌(NCT02316457)和黑色素瘤(NCT02410733)的治療方案正處于臨床評(píng)估的早期階段。LNP-mRNA疫苗誘導(dǎo)的瞬時(shí)蛋白表達(dá)非常適合應(yīng)用于對(duì)抗感染和癌癥。當(dāng)然，除了疫苗之外，LNP制劑是需要靜脈注射的，這會(huì)給醫(yī)療系統(tǒng)帶來了很大的負(fù)擔(dān)。因此，目前我們將治療應(yīng)用限制在罕見或危及生命的疾病上。

用于運(yùn)送大量有效核酸的載體平臺(tái)技術(shù)也使得基于基因編輯的療法的臨床轉(zhuǎn)化成為可能。與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)不同，基因編輯可以治療顯性負(fù)突變引起的疾病。此外，基因編輯可以利用精確的工程設(shè)計(jì)，使基因的插入或校正由內(nèi)源啟動(dòng)子控制，并且可以在生理上得到準(zhǔn)確的表達(dá)。除了體外方法外，幾種體內(nèi)基因編輯療法(NCT03041324、NCT02702115、NCT04601051、NCT03872479)通過LNP或AAV載體技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)，用于治療視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良、hATTR和代謝紊亂，目前這些療法已經(jīng)到達(dá)了進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化階段。

一般來說，已經(jīng)批準(zhǔn)的一些平臺(tái)技術(shù)的耐受性良好，但納米顆粒、大分子和生物制劑通常需要預(yù)先或聯(lián)合用藥來抑制不良的免疫相關(guān)反應(yīng)。例如，接受Onpattro治療的患者在至少治療前60分鐘需要聯(lián)合服用地塞米松、對(duì)乙酰氨基酚和抗組胺藥物。對(duì)于Glybera來說，患者在輸液前三天需要口服環(huán)孢素和霉酚酸酯，并在輸液前30分鐘接受甲基強(qiáng)的松龍治療。由于大多數(shù)被批準(zhǔn)的核酸療法是用于治療一些幾乎沒有治療方案的罕見或單基因疾病的，因此，這些潛在的不良反應(yīng)相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)是合理的。

隨著核酸療法對(duì)患者臨床益處的逐漸顯現(xiàn)出，其治療價(jià)格等相關(guān)的社會(huì)經(jīng)濟(jì)問題(表1)也受到了廣泛討論。臨床結(jié)果是否能夠證明高成本是合理的？這一復(fù)雜的問題取決于許多因素，包括治療效果的持續(xù)時(shí)間和幅度、疾病的罕見程度、相關(guān)的嚴(yán)重程度或終生發(fā)病率、替代治療方案的成本、醫(yī)療保健和保險(xiǎn)模式，以及最終患者生活質(zhì)量的整體改善等。

顯然，對(duì)于產(chǎn)生長期療效的核酸療法--例如Zolgensma、Strimvelis或Luxturna高昂的藥價(jià)似乎是合理的。對(duì)于Spinraza、Tegsedi和Onpattro等產(chǎn)生顯著但短暫療效的藥物，目前的治療定價(jià)可能不能很好地切合患者的長期治療效益。此外，由于目前批準(zhǔn)的一些核酸療法是針對(duì)超罕見疾病開發(fā)的，因此對(duì)這些療法的需求非常有限。第一個(gè)被批準(zhǔn)的基因療法Glybera就是一個(gè)例子：雖然非常有效，但由于需求低和治療成本高導(dǎo)致獲得治療的機(jī)會(huì)有限，最終它被市場所淘汰。目前，幾家基因藥物公司正在施行簽訂基于治療結(jié)果的協(xié)議。根據(jù)該協(xié)議，付款數(shù)額取決于治療成功或療效持續(xù)的時(shí)間。還有一些其他有爭議的做法，就像“彩票”制度。舉個(gè)例子來說，每年會(huì)有100劑Zolgensma捐贈(zèng)給患有SMA并生活在美國境外的兩歲以下兒童。鑒于當(dāng)前新冠肺炎期間的疫苗開發(fā)，定價(jià)也一直是爭論的話題。雖然mRNA疫苗的價(jià)格(30?40美元)高于傳統(tǒng)疫苗或病毒載體疫苗(2?5美元)，但與全球新冠肺炎疫情造成的直接和間接成本相比，這一價(jià)格相形見絀。此外，mRNA疫苗這種前所未有的開發(fā)速度也將有助于經(jīng)濟(jì)的重新復(fù)蘇。

這篇綜述中描述的四種平臺(tái)技術(shù)有助于將核酸療法從理論轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐。雖然目前批準(zhǔn)的大多數(shù)核酸療法的目標(biāo)是治療疾病，但它們的遞送技術(shù)現(xiàn)在正被用于更廣泛適用的基因藥物，并使疫苗在大流行時(shí)期得以快速開發(fā)。此外，這些平臺(tái)正在促進(jìn)新方法的臨床轉(zhuǎn)化，如基因編輯療法。盡管它們的廣泛實(shí)施仍然面臨一些挑戰(zhàn)，包括制造、毒性和社會(huì)經(jīng)濟(jì)問題，但很明顯，核酸療法將對(duì)許多以前治療選擇有限或沒有選擇的疾病產(chǎn)生革命性的影響。