在細(xì)胞系中敲入報(bào)告基因是CRISPR/Cas9最常見的應(yīng)用之一，本文詳細(xì)介紹了報(bào)告細(xì)胞系的原理、構(gòu)建策略以及應(yīng)用前景，希望能給廣大科研工作者提供一個(gè)比較前沿的研究思路。

1.什么是報(bào)告細(xì)胞系和報(bào)告基因？

報(bào)告細(xì)胞系是指那些用報(bào)告基因標(biāo)記的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，可用于可視化、跟蹤和分離目的基因。報(bào)告細(xì)胞系可通過(guò)由目的基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的、帶有易檢測(cè)的標(biāo)簽（如GFP）的外源表達(dá)來(lái)產(chǎn)生。然而，由于外源表達(dá)水平可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成不可預(yù)知的影響，因此研究人員更傾向于具有內(nèi)源表達(dá)報(bào)告基因。在這種情況下，通過(guò)將標(biāo)簽（例如GFP）敲入到目的基因的啟動(dòng)子下游來(lái)產(chǎn)生的報(bào)告細(xì)胞系是最佳的選擇。

報(bào)告分子可以是熒光蛋白和發(fā)光蛋白。如綠色熒光蛋白（GFP），當(dāng)它暴露于藍(lán)色至紫外線范圍內(nèi)的光時(shí)就會(huì)顯示亮綠色熒光；而熒光素酶（luciferase）則催化與熒光素的反應(yīng)并產(chǎn)生光。在其他情況下，報(bào)告分子也可以是與目的基因融合的標(biāo)簽，例如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST），組氨酸（HIS）和flag標(biāo)簽。針對(duì)目的基因的產(chǎn)物，這些標(biāo)簽可用于基于抗體的檢測(cè)和基于親和力的蛋白分離。

2.產(chǎn)生報(bào)告細(xì)胞系的敲入方案/策略

為了引入外源DNA，需要將報(bào)告基因整合進(jìn)基因組。研究人員可以在靶基因啟動(dòng)子的下游直接引入報(bào)告基因編碼序列（例如eGFP）（見圖1B）。另一種策略是用報(bào)告基因編碼序列替換掉靶基因的特定基因座并產(chǎn)生截短蛋白（見圖1C）。也可以用IRES連接報(bào)告基因和目的基因，在天然轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的控制下作為單個(gè)轉(zhuǎn)錄物與內(nèi)源基因共表達(dá)（見圖1D）。此外，報(bào)告基因編碼序列也可以引入到終止密碼子之前的N/C末端并由內(nèi)源啟動(dòng)子控制（圖1E）。這些策略常用于產(chǎn)生敲入細(xì)胞模型，如圖1所示。

圖1: 報(bào)告基因敲入的常見策略

3.報(bào)告細(xì)胞系的應(yīng)用前景

研究基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性

具有內(nèi)源標(biāo)記基因的細(xì)胞系可以讓研究人員能夠在活細(xì)胞中實(shí)時(shí)跟蹤蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和定位。這些細(xì)胞系也適用于蛋白質(zhì)印跡，蛋白質(zhì)分離純化，親和層析，免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)等。當(dāng)沒(méi)有好用的抗體時(shí)，利用這些細(xì)胞系也是一個(gè)好的解決辦法。當(dāng)內(nèi)源基因被敲除的同時(shí)，報(bào)告基因通過(guò)同源重組被敲入，以達(dá)到目的基因被報(bào)告基因（例如EGFP）所取代的目的。重組后，目的基因的啟動(dòng)子將調(diào)節(jié)被插入的報(bào)告基因的表達(dá)。通過(guò)熒光素酶敲入來(lái)研究人SREBP1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控就是其中一個(gè)應(yīng)用例子。在這項(xiàng)研究中，研究人員將一份外源熒光素酶基因整合到宿主基因組的一個(gè)等位基因中，另一個(gè)等位基因被刪掉目標(biāo)序列中的14 bp。熒光素酶活性與HEK293-SREBP1-T2A-luciferase敲入細(xì)胞系中內(nèi)源性SREBP1基因的啟動(dòng)子活性有著直接相關(guān)的關(guān)系。

蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的表達(dá)，定位和轉(zhuǎn)運(yùn)

基因表達(dá)的可視化可以通過(guò)將標(biāo)簽序列添加到目的基因的末端（或起始端）并產(chǎn)生融合蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)。然后我們就可以利用熒光來(lái)持續(xù)監(jiān)測(cè)內(nèi)源蛋白和重組蛋白的表達(dá)水平。利用這個(gè)熒光報(bào)告分子就可以定量任何你想要的進(jìn)行定量的蛋白質(zhì)。GFP-LC3 293FT報(bào)告基因敲入細(xì)胞就是一個(gè)應(yīng)用例子（圖3），其中GFP被添加到內(nèi)源性LC3的N-末端。因此，構(gòu)建敲入報(bào)告基因的GFP-LC3就可以進(jìn)行GFP-LC3融合蛋白表達(dá)，且表達(dá)是由內(nèi)源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的，并不會(huì)改變靶基因的表達(dá)。內(nèi)源性GFP-LC3報(bào)告系統(tǒng)顯示細(xì)胞自噬活性的準(zhǔn)確的鑒定和定量。內(nèi)源性GFP-LC3報(bào)告系統(tǒng)通過(guò)應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬以及藥物（雷帕霉素）誘導(dǎo)/抑制自噬研究來(lái)驗(yàn)證。如作者所示，游離GFP蛋白增加，其信號(hào)仍然分散，但在誘導(dǎo)自噬時(shí)更強(qiáng)，而GFP-LC3在自噬抑制時(shí)會(huì)變成點(diǎn)狀。

圖3: 293FT細(xì)胞中MAP1LC3B基因座處敲入GFP-LC3。

候選藥物的目標(biāo)識(shí)別和評(píng)估

KI細(xì)胞系可用于藥物靶標(biāo)鑒定和候選評(píng)估。一旦選擇特定基因作為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)KI方案，將目的基因與敏感度高的報(bào)告基因融合（如螢火蟲熒光素酶基因）的細(xì)胞模型，產(chǎn)生易于測(cè)量的光信號(hào)，反映目的基因轉(zhuǎn)錄的變化。當(dāng)用適當(dāng)化合物處理KI細(xì)胞系時(shí)，就可以產(chǎn)生反映基因表達(dá)特定變化的光信號(hào)。 因此，利用報(bào)告細(xì)胞系的測(cè)定可以做到快速篩選大量樣品并排除那些具有細(xì)胞毒性或不能與細(xì)胞相互作用的化合物。其中，作為利用報(bào)告細(xì)胞系來(lái)評(píng)估藥物靶標(biāo)的一個(gè)例子，HELA細(xì)胞系被核蛋白（Histone 1-mtagBFP2），細(xì)胞骨架標(biāo)記物（βtubulin-mClover3），和已知的自噬受體蛋白（SQSTM1-mRuby3）標(biāo)記，以篩選能誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)自噬囊泡積累的激酶抑制劑（具有已知靶標(biāo)），從而評(píng)估自噬囊泡的積累。研究人員用兩種激酶抑制劑PLK1抑制劑BI-6727和PIM激酶抑制劑CX-6258來(lái)處理細(xì)胞，這兩種激酶抑制劑會(huì)增加自噬囊泡的數(shù)量，例如一種已知的自噬抑制劑——羥氯喹（圖4）。

圖4: 三重標(biāo)記的HELA細(xì)胞系中誘導(dǎo)自噬囊泡積累的激酶抑制劑的驗(yàn)證。

總結(jié)以上發(fā)現(xiàn)，通過(guò)基因敲入產(chǎn)生的報(bào)告細(xì)胞模型對(duì)于功能研究（例如監(jiān)測(cè)基因表達(dá)和亞細(xì)胞定位）是常用的，且有利于進(jìn)行高通量藥物篩選。