Nat. Chemical Biol. | 諾獎得主發(fā)表的CRISPR最新、最全的基因編輯研究綜述！...

昵稱37581541 2020-12-23

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許多細菌和古細菌生物使用CRISPR-Cas系統(tǒng)來保護自身免受移動遺傳元件侵害。這些CRISPR-Cas系統(tǒng)根據(jù)其組成和機制可分為多種類型。目前CRISPR-Cas酶被廣泛用于基因組編輯，治療遺傳類疾病。為了充分了解并利用CRISPR-Cas系統(tǒng)的潛能，合理的控制其酶活性時間、持續(xù)時間、效率和特異性至關(guān)重要。近日，美國加利福利亞大學的分子與細胞生物學系和創(chuàng)新基因組學研究所合作，在《nature chemical biological》上發(fā)表了一篇題為 “Controlling and enhancing CRISPR systems” 的綜述。此綜述討論了天然CRISPR-Cas調(diào)節(jié)生物分子的機制，以及如何通過改變酶的功能來增強或者抑制CRISPR-Cas免疫。文章還討論了CRISPR技術(shù)在生物學領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價值。

CRISPR–Cas系統(tǒng)為各種細菌和古細菌提供了對入侵的移動遺傳元件(MGEs)的適應(yīng)性免疫力。這種天然存在的免疫系統(tǒng)已被重新用于基因組工程技術(shù)。在CRISPR陣列兩側(cè)是多個保守的蛋白編碼基因，這些基因在CRISPR介導免疫的不同階段發(fā)揮作用，通常以“ CRISPR關(guān)聯(lián)”(Cas)為前綴。CRISPR-Cas免疫可分為三個階段：適應(yīng)、生物發(fā)生和干擾。在此綜述中，他們描述了CRISPR系統(tǒng)調(diào)控的基本機制以及如何增強對自然界和實驗室中CRISPR酶的控制能力。

CRISPR–Cas基因表達的調(diào)控

在許多細菌基因組中，CRISPR-Cas系統(tǒng)受到基因調(diào)控的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后模式的控制(Fig. 1和Table 1)。轉(zhuǎn)座子誘變實驗發(fā)現(xiàn)CRISPR–Cas組裝受到多個轉(zhuǎn)錄因子控制，除轉(zhuǎn)錄因子外，RNA調(diào)控機制還能促進或者抑制 CRISPR基因座的表達。

Fig. 1 | CRISPR基因座在不同環(huán)境下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

控制CRISPR效應(yīng)子

細菌和噬菌體經(jīng)歷了反復的適應(yīng)和反適應(yīng)循環(huán)，這很可能導致CRISPR系統(tǒng)的多樣化。由于這種細菌-噬菌體軍備競賽，噬菌體還進化出了能對抗CRISPR防御系統(tǒng)的蛋白質(zhì)(Acrs)。與CRISPR–Cas效應(yīng)子相似，Acrs高度多樣化，有約90個不同的家族。Acrs的抑制強度，特異性和機制各不相同，其中大多數(shù)抵消了特定CRISPR系統(tǒng)的特定Cas直向同源物。從機理上來講，Acrs可細分為三個子類：競爭性，變構(gòu)和酶抑制劑 (Fig. 2 和Table 2)。除了在噬菌體區(qū)域內(nèi)編碼的Acrs外，細菌和古細菌基因組還包含CRISPR–Cas基因組附近的輔助調(diào)控因子。這些輔助蛋白大多數(shù)與靶向RNA的III型和VI型CRISPR系統(tǒng)相關(guān)。

Fig. 2 | Acrs抑制CRISPR活性的不同策略

增強III型CRISPR免疫

III型CRISPR系統(tǒng)包括A–F亞型，對于此系統(tǒng)機制的理解都來源于對III-A和III-B系統(tǒng)的研究。這兩個系統(tǒng)的多亞基效應(yīng)物復合物中均包含Cas10 (在III-A中稱為Csm1，在III-B中稱為Cmr2)。效應(yīng)物復合體的Cas10亞基由一個組氨酸-天冬氨酸(HD)核酸酶結(jié)構(gòu)域和兩個在結(jié)構(gòu)上類似于聚合酶-環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域的棕櫚結(jié)構(gòu)域組成，其中一個棕櫚結(jié)構(gòu)域包含一個催化性GGDD基序(Fig. 3)。Csm6 / Csx1在N端包含一個CARF域，在C端包含一個較高的真核生物和原核生物核苷酸結(jié)合(HEPN)域。兩種單體的CARF結(jié)構(gòu)域形成高度保守的帶正電荷的裂縫，用作cOA結(jié)合位點(Fig. 3)。通過III型CRISPR系統(tǒng)的基因組鄰近區(qū)域時鑒定出許多輔助蛋白，包括Csm6 / Csx1。另一個含有輔助蛋白CRISPR輔助核酸酶1(Can1)的CARF結(jié)構(gòu)域的生化特性表明，它可以通過切割超螺旋DNA來補充III型CRISPR免疫。與Csm6 / Csx1相似，兩個CARF域之間的接口構(gòu)成了cA4結(jié)合口袋。結(jié)合cA4后，Can1進行結(jié)構(gòu)重排，激活了金屬依賴性非特異性核酸酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域隨后形成超螺旋DNA的切口。當DNA發(fā)生超螺旋時，Can1的這種活性可用于在復制或轉(zhuǎn)錄過程中靶向噬菌體DNA (Fig. 4)。一些III型CRISPR–Cas基因座還包含NucC的同源物，NucC是細菌防御系統(tǒng)基于環(huán)寡核苷酸的抗噬菌體信號傳導系統(tǒng)(CBASS)的效應(yīng)子核酸酶。NucC除了在CBASS防御系統(tǒng)中的作用外，還可能作為III型CRISPR途徑一部分的輔助核酸酶 (Fig. 4)。此外，通過蛋白質(zhì)相互作用研究，還鑒定出了核酸酶PNPase和RNase J2，它們與III型CRISPR組分相關(guān)，并在能夠有效清除病原體的轉(zhuǎn)錄本(Fig. 4)。

Fig. 3 | III型CRISPR系統(tǒng)中的coA信號傳導

Fig. 4 | III型CRISPR–Cas免疫

VI CRISPR系統(tǒng)的調(diào)控元件

VI型CRISPR系統(tǒng)是RNA導向的RNA靶向系統(tǒng)，可進一步細分為VI A-D型。這些系統(tǒng)至少包含兩個HEPN結(jié)構(gòu)域，但是其位置的序列和結(jié)構(gòu)域組織有差異。VI-B型系統(tǒng)的獨特之處在于它們在位點包含輔助跨膜(TM)蛋白(Csx27和Csx28)。Csx28機制的普遍假設(shè)是，它充當了額外的反式RNase (Fig. 5b)。VI-D系統(tǒng)還包含輔助蛋白，可增強Cas13d活性。在Ruminococcus Sp中發(fā)現(xiàn)RspWYL1，它的N端結(jié)構(gòu)域由一個DNA結(jié)合帶狀螺旋-螺旋基序、一個WYL結(jié)構(gòu)域和一個寡聚C-端結(jié)構(gòu)域組成。盡管詳細的機制仍在研究中，但已顯示RspWYL1與Cas13d的相互作用較弱，并且對ssRNA具有高親和力。根據(jù)現(xiàn)有證據(jù)，可以提出兩種模型來實現(xiàn)增強的RNA靶向性。在模型1中，輔助蛋白增加Cas蛋白周圍RNA的局部濃度和/或變構(gòu)刺激Cas活性 (Fig. 5a)。在模型2中，分布了輔助核酸酶，可以增強Cas系統(tǒng)的RNA靶向活性(Fig. 5b)。

Fig. 5 | CRISPR相關(guān)輔助蛋白的潛在機制

CRISPR的應(yīng)用

CRISPR-Cas蛋白作為轉(zhuǎn)化治療劑和研究工具的出現(xiàn)要求對它們在時間和空間上的活性進行精確且可調(diào)的控制。CRISPR-Cas蛋白具有很高的科學和生物醫(yī)學價值，它刺激了多種策略的工程設(shè)計，更適合于精確控制時空控制其在原核細胞外的表達和活性(Fig. 6)。