【原】生物分析專欄 | 生物分析法規(guī)的解讀與展望

醫(yī)藥魔方 2020-11-06

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生物分析是指利用色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、配體結(jié)合法等技術(shù)對(duì)生物基質(zhì)中的目標(biāo)物進(jìn)行定量分析。生物分析包括對(duì)基質(zhì)中藥物、代謝產(chǎn)物、蛋白質(zhì)、多肽等大小分子的分析。在制藥行業(yè)中，生物分析已被廣泛應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)和藥物研發(fā)過程中，如藥代動(dòng)力學(xué)、毒代動(dòng)力學(xué)、一致性評(píng)價(jià)、生物利用度、藥效動(dòng)力學(xué)等。在許多非制藥的研究領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用，如法醫(yī)學(xué)分析、興奮劑控制和鑒定、用于疾病診斷的生物標(biāo)志物定性和定量分析等。

生物分析的對(duì)象為生物基質(zhì)或生物樣本，通常包括：血清、血漿、皮膚、血液、尿液、唾液、淚液、腦脊液和其他器官組織等，其特殊性表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

生物基質(zhì)成分復(fù)雜；
某一類別的基質(zhì)非常稀缺或者難于獲?。ㄈ纾耗X脊液）；
同一個(gè)體在不同時(shí)間或不同狀態(tài)下，或不同個(gè)體間、種族間差異較大；
生物樣本中藥物濃度較低。

生物分析是一套涉及樣品收集與儲(chǔ)存、處理、進(jìn)樣分析、數(shù)據(jù)分析及報(bào)告等多步驟的流程，如圖1所示。

圖1 生物分析流程

生物樣本通常需進(jìn)行前處理才可進(jìn)行分析，生物樣本常用的前處理方法包括：液液萃取法（Liquid-Liquid Extraction）、固相萃取法（hase Extraction）以及沉淀蛋白法（Protein Precipitation）。常見的分析方法為：色譜法（Chromatographic Assays , CC）和配體結(jié)合法（Ligand Binding Assays, LBA）。

正是由于生物基質(zhì)的特性以及生物分析過程復(fù)雜性，故要求生物分析方法必須確保在一段時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生可靠和可重復(fù)的結(jié)果，而生物分析方法驗(yàn)證（Bioanalytical Method Validation， BMV）則有助于獲得可靠的結(jié)果，這對(duì)于正確決定藥物劑量和患者安全性是非常必要的。

生物分析法規(guī)的發(fā)展史

雖然制藥行業(yè)對(duì)生物分析在藥物研發(fā)領(lǐng)域發(fā)揮的重要作用不可否認(rèn)，但在1990年之前，對(duì)生物分析方法的發(fā)展和驗(yàn)證的關(guān)注程度較低，在世界范圍內(nèi)無相關(guān)的生物分析的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，這就造成遞交至藥品監(jiān)管和審批部門的生物樣本分析相關(guān)資料參差不齊。

直到1990年，這一領(lǐng)域才有了重大進(jìn)展。1990年，由美國藥學(xué)會(huì)（American Association of Pharmaceutical Scientists，AAPS）、食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）、國際制藥聯(lián)合會(huì)（International Pharmaceutical Federation，F(xiàn)IP）、加拿大健康保護(hù)處( Health Protection Branch，HPB）、分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（ Association of Analytical Chemists，AOAC）共同主辦、在水晶城召開第一屆生物分析方法驗(yàn)證研討會(huì)（The first Bioanalytical Method Validation Workshop）開啟了生物分析方法的規(guī)范化“之門”。經(jīng)過對(duì)1990 年至1999年之間經(jīng)驗(yàn)的整理及 2000 年對(duì)生物分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則草案的討論，F(xiàn)DA在2001年首次頒布實(shí)施生物分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，這一指導(dǎo)原則的頒布和實(shí)施對(duì)生物分析領(lǐng)域的規(guī)范化具有劃時(shí)代的指導(dǎo)意義。

在2001年FDA在頒布實(shí)施生物分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則之后，世界其他各國也開始建立適合本國的生物分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則。歐洲藥品管理局（EMA）于2012 年2 月1 日正式發(fā)布生物分析指導(dǎo)原則且至今有效。2013年，日本厚生勞動(dòng)省（MHLW）參考了FDA和EMA指導(dǎo)原則以及AAPS的工作報(bào)告，制定并頒布了日本境內(nèi)的制藥行業(yè)中的BMV的指導(dǎo)原則并延用至今；中國于2015年在《中國藥典》（2015版, ChP）中正式頒布了《9012生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》并延用至今。

FDA在2001年頒布了第一版本的BMV指導(dǎo)原則后于2013年又發(fā)布了草案版本，用于征求工業(yè)界的對(duì)于BMV的意見，后于2018年5月份正式發(fā)布了定稿版本的《Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry》并延用至今。世界范圍內(nèi)建立相應(yīng)的BMV指導(dǎo)原則時(shí)間如表1所示。

表1 發(fā)布BMV指導(dǎo)原則的主要機(jī)構(gòu)及時(shí)間

雖然自2001年以后，各國都在建立或考慮建立相應(yīng)的BMV指導(dǎo)原則，但從2009開始，業(yè)界對(duì)BMV “擔(dān)憂”也逐漸顯現(xiàn)并持續(xù)至今，擔(dān)憂主要涉及兩個(gè)方面，一是個(gè)人或地區(qū)對(duì)BMV指導(dǎo)原則的解讀或理解存在差異；再則生物分析方法應(yīng)用于不同地區(qū)時(shí)，對(duì)指導(dǎo)原則理解上的細(xì)微差別將給行業(yè)帶來風(fēng)險(xiǎn)。

為了消除以上擔(dān)憂，行業(yè)表達(dá)了對(duì)生物分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則統(tǒng)一的強(qiáng)烈愿望。為此，在全球生物分析聯(lián)盟（GBC）、AAPS、MHLW、日本生物分析論壇(JBF)、歐洲生物分析論壇(EBF)、歐洲制藥工業(yè)協(xié)會(huì)聯(lián)合會(huì)（European Federation of Pharmaceutical Industries and Associations， EFPIA）以及ICH等多個(gè)機(jī)構(gòu)多年的共同努力下，ICH于2019年02月26日發(fā)布了生物分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則《BIOANALYTICAL METHOD VALIDATION》的Draft版（以下簡稱M10）。針對(duì)M10的發(fā)布，多國均公開征求各方意見，各成員要求BMV消除理解差異以及區(qū)域差異以及尋求統(tǒng)一的迫切心情可見一斑, M10草案發(fā)布為生物分析方法驗(yàn)證的統(tǒng)一帶來了一縷曙光。

主要的生物分析法規(guī)比較和解讀

截止2020年4月，美國、歐盟、中國、日本，韓國、加拿大、巴西等均發(fā)布適合本區(qū)域內(nèi)或者本組織的BMV指導(dǎo)原則。這些生物分析指導(dǎo)原則中主體內(nèi)容基本相似，但也并非完全相同，個(gè)別驗(yàn)證參數(shù)上也存在一定差異。本文將對(duì)在世界范圍影響力深遠(yuǎn)且有代表意義的FDA、 EMA、ICH發(fā)布的BMV的指導(dǎo)原則以及對(duì)我國的生物分析領(lǐng)域具有明確指導(dǎo)意義BMV的指導(dǎo)原則進(jìn)行深度的比較和解讀，包括：指導(dǎo)原則的適用范圍、方法開發(fā)要求、驗(yàn)證類型、色譜法驗(yàn)證參數(shù)和接受標(biāo)準(zhǔn)、配體結(jié)合法驗(yàn)證參數(shù)和接受標(biāo)準(zhǔn)、已測樣品再分析（ISR）、內(nèi)源性物質(zhì)的檢測要求。

1 指導(dǎo)原則的適用范圍

了解BMV指導(dǎo)原則的適用范圍對(duì)于藥物注冊(cè)申報(bào)非常必要，比較以上指導(dǎo)原則的適用范圍可以發(fā)現(xiàn)：以上指導(dǎo)原則均適用于采用色譜法和配體結(jié)合分析法進(jìn)行的藥物以及代謝物定量結(jié)果分析，但是對(duì)于生物標(biāo)志物的態(tài)度則不同，M10明確表明不適用于生物標(biāo)志物和免疫原性分析，該范圍與EMA于2012年發(fā)布的《 Guideline on bioanalytical method validation》（下文簡稱: EMA/BMV/2012）以及中國藥典2015版本中的《9012生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》（下文簡稱: ChP/9012/2015）一致，而FDA于2018年5月發(fā)布的《Bioanalytical Method validation Guidance for Industry》（下文簡稱: FDA/BMV/2018）適用范圍比M10略廣，除了適用藥物以及代謝物的定量結(jié)果分析外，還適用于非臨床的生物標(biāo)志物的評(píng)估，從而也可以解讀出以上機(jī)構(gòu)對(duì)于生物標(biāo)志物分析的均采取非常慎重的態(tài)度，主要原因是生物標(biāo)志物在評(píng)價(jià)新型治療產(chǎn)品或者藥物的安全性、活性或有效性方面發(fā)揮著舉足輕重的作用，因此必需要確保生物標(biāo)志物的分析方法產(chǎn)生數(shù)據(jù)的完整性和科學(xué)性。

FDA在本指導(dǎo)原則中也表達(dá)了對(duì)于生物標(biāo)志物檢測的建議，評(píng)估藥物研發(fā)過程中的生物標(biāo)志物分析方法驗(yàn)證的適當(dāng)程度時(shí)，應(yīng)使用目的適用性評(píng)估的概念（The fit-for-purpose ，F(xiàn)FP），即分析方法驗(yàn)證的程度應(yīng)該與研究的既定目的相適應(yīng)和匹配。

2 方法開發(fā)要求

對(duì)于方法開發(fā)部分，而EMA/BMV/2012、ChP/9012/2015未做特別說明， M10與FDA/BMV/2018要求基本相同：對(duì)開發(fā)的過程、關(guān)注的指標(biāo)以及記錄進(jìn)行了簡單要求，強(qiáng)調(diào)了方法開發(fā)的過程，同時(shí)也接受比較開放的方式，即：方法開發(fā)過程中如何記錄、審查、歸檔以及報(bào)告由生物分析實(shí)驗(yàn)室自行決定，因?yàn)榱己玫姆椒ㄩ_發(fā)可以為實(shí)驗(yàn)室提高檢測效率和節(jié)省成本提供了巨大的機(jī)會(huì)。

3 驗(yàn)證類型

以上BMV指導(dǎo)原則均從結(jié)構(gòu)上拆分為方法開發(fā)、方法驗(yàn)證以及樣本分析3個(gè)階段，其中方法學(xué)驗(yàn)證又分為全驗(yàn)證、部分驗(yàn)證和交叉驗(yàn)證。無論是色譜法還是配體結(jié)合分析法，全驗(yàn)證包括的主要指標(biāo)基本相同，但略有差異，見表2，對(duì)于部分驗(yàn)證和交叉驗(yàn)證的適用條件也基本相同，差異微小，見表3。對(duì)于部分驗(yàn)證，M10、FDA/BMV/2018、EMA/BMV/2012以及ChP/9012/2015均未做明確說明，可操作空間較大，實(shí)驗(yàn)室可以基于科學(xué)性論證后進(jìn)行部分驗(yàn)證：可以僅是一個(gè)準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證(A&P run)，也可以近乎全驗(yàn)證。

表2 生物分析方法全驗(yàn)證參數(shù)比較匯總

注：（+）：只提及，未明確評(píng)估方法和接受標(biāo)準(zhǔn)；+：需進(jìn)行此項(xiàng)考察并設(shè)立接受標(biāo)準(zhǔn)； <+>：提及做法，未明確接受標(biāo)準(zhǔn)；-：未提及。

表3 分析方法部分驗(yàn)證和交叉驗(yàn)證條件比較

注：＋：當(dāng)對(duì)應(yīng)條件改變時(shí)需要進(jìn)行部分驗(yàn)證；-：未提及

4 色譜法驗(yàn)證參數(shù)和接受標(biāo)準(zhǔn)

EMA/BMV/2012 、ChP/9012/2015以及M10對(duì)色譜法和配體結(jié)合分析法進(jìn)行分開描述， FDA/BMV/2018也將色譜法和配體結(jié)合法的驗(yàn)證參數(shù)分別在表格中進(jìn)行匯總，雖然行文內(nèi)容上有些重復(fù)，但是兩種檢測方法檢測原理和操作團(tuán)隊(duì)通常不同，非常利于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作和管理。色譜法相對(duì)于配體結(jié)合法更為成熟，驗(yàn)證的內(nèi)容和接受標(biāo)準(zhǔn)見表4。

表4 色譜法驗(yàn)證參數(shù)和接受標(biāo)準(zhǔn)的比較結(jié)果

色譜法發(fā)展多年，各個(gè)指導(dǎo)原則中驗(yàn)證內(nèi)容和接受標(biāo)準(zhǔn)差異較小，其中較明顯的差異包括：

（1）對(duì)于選擇性，EMA/BMV/2012、ChP/9012/2015強(qiáng)調(diào)聯(lián)合用藥、代謝物、降解產(chǎn)物的影響，未單獨(dú)要求特異性考察，全部放到選擇性下進(jìn)行考察，接受標(biāo)準(zhǔn)與選擇性相同，M10除了常規(guī)要求外，特別強(qiáng)調(diào)了高脂基質(zhì)的選擇性考察要求：高脂基質(zhì)應(yīng)取自于捐獻(xiàn)者，難于獲取的可以用甘油三酯配置，當(dāng)藥物影響脂代謝或者用于高脂人群時(shí)必須采用捐獻(xiàn)者的基質(zhì)。

（2）對(duì)于基質(zhì)效應(yīng)，EMA/BMV/2012和ChP/9012/2015給出了具體的做法，即：采用內(nèi)標(biāo)歸一化因子進(jìn)行評(píng)價(jià)，具有實(shí)際的指導(dǎo)意義；M10則采用不同來源的基質(zhì)制備的質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度和精密度來評(píng)價(jià)，特別強(qiáng)調(diào)了高脂基質(zhì)、溶血基質(zhì)、肝功能不全患者、腎功能不全患者等特殊基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)考察要求；而FDA/BMV/2018在這一重要方法參數(shù)上沒給出具體的操作方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)。

（3）對(duì)于分析批容量，只有M10特別強(qiáng)調(diào)了考察要求，要求采用含基質(zhì)樣品進(jìn)行考察，且分析批容量能覆蓋實(shí)際的研究樣品檢測時(shí)的分析批容量。

（4）對(duì)于重進(jìn)樣重現(xiàn)性，ChP/9012/2015中要求如發(fā)生儀器中斷或者設(shè)備故障造成的重進(jìn)樣時(shí)應(yīng)評(píng)價(jià)，如何評(píng)價(jià)以及接受標(biāo)準(zhǔn)未做明確要求，M10明確了考察方式和要求，而EMA/BMV/2012和FDA/BMV/2018未強(qiáng)調(diào)該要求。

（5）對(duì)于靈敏度， FDA/BMV/2018要求LLOQ的信噪比應(yīng)大于5，EMA/BMV/2012、ChP/9012/2015除了上述要求外，還要求LLOQ應(yīng)滿足小于等于Cmax的5%，而M10對(duì)此并無規(guī)定，只要分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度滿足要求即可。

（6）對(duì)于提取回收率，EMA/BMV/2012、ChP/9012/2015未做要求，F(xiàn)DA/BMV/2018和M10均要求對(duì)回收率進(jìn)行考察，且明確了內(nèi)標(biāo)與待測物回收率應(yīng)一致,但并未給出具體的接受標(biāo)準(zhǔn)，如何科學(xué)合理的設(shè)立這一標(biāo)準(zhǔn)也必將成為業(yè)界的一個(gè)論點(diǎn)。

5 配體結(jié)合法驗(yàn)證參數(shù)和接受標(biāo)準(zhǔn)

對(duì)于配體結(jié)合分析方法， M10與EMA/BMV/2012、FDA/BMV/2018、ChP/9012/2015驗(yàn)證的內(nèi)容基本相同，包括：特異性、選擇性、標(biāo)準(zhǔn)曲線及范圍（定量下限至定量上限）、準(zhǔn)確度、精密度、殘留（如有必要）、稀釋線性、平行性（如必要）和穩(wěn)定性，考察方法和接受標(biāo)準(zhǔn)上基本相同, 各個(gè)指導(dǎo)原則考察項(xiàng)和接受標(biāo)準(zhǔn)的異同點(diǎn)詳見表5。

表5 配體結(jié)合法驗(yàn)證參數(shù)及接受標(biāo)準(zhǔn)比較

注：LLOQ: 定量下限；ULOQ:定量上限；MQC:中濃度質(zhì)控樣品；HQC:高濃度質(zhì)控樣品；DQC：稀釋質(zhì)控。

對(duì)于配體結(jié)合法，各個(gè)指導(dǎo)原則中驗(yàn)證的內(nèi)容和接受標(biāo)準(zhǔn)雖差異較小，但也不完全相同，差異主要集中在特異性、選擇性、殘留、穩(wěn)定性條件的覆蓋范圍以及平行性上。

6 已測樣品再分析（ISR）

已測樣品再分析（Incurred Sample Reanalysis，ISR）通過在一定時(shí)間周期內(nèi)重復(fù)分析試驗(yàn)樣品，評(píng)價(jià)生物分析方法對(duì)實(shí)際樣品測定的準(zhǔn)確程度，是方法學(xué)驗(yàn)證的重要部分。M10、EMA/BMV/2012 、FDA/BMV/2018 以及ChP/9012/2015在ISR開展情形、樣品選擇、接受標(biāo)準(zhǔn)上保持相同，但對(duì)于ISR過程中的異常情況以及異常結(jié)果的調(diào)查上，F(xiàn)DA/BMV/2018、 EMA/BMV/2012 、ChP/9012/2015意見不明確，要求各個(gè)實(shí)驗(yàn)室遵循既定的SOP或者調(diào)查方案，M10給出相對(duì)具體的操作和處理意見：

（1）強(qiáng)調(diào)原始數(shù)據(jù)的不可替代性。

（2）對(duì)于需要進(jìn)行關(guān)注及調(diào)查的情況也做了明確：ISR失敗、同一受試者的所有樣品ISR均失敗、同一分析批的所有樣品ISR均失敗，此時(shí)應(yīng)對(duì)ISR進(jìn)行關(guān)注和調(diào)查。對(duì)于ISR調(diào)查和評(píng)估的所有情況都應(yīng)記錄，以便改進(jìn)和調(diào)查。

（3）對(duì)無需進(jìn)行關(guān)注及調(diào)查的情況也做了明確：當(dāng)個(gè)別樣品原始值與ISR值有很大差異時(shí)（如，> 50％，“異常值”）不應(yīng)對(duì)原始樣品進(jìn)行重新分析，也不需要進(jìn)行調(diào)查。

筆者認(rèn)為此種要求會(huì)限制數(shù)據(jù)的客觀性，實(shí)驗(yàn)室可能的取樣錯(cuò)誤可以通過ISR來發(fā)現(xiàn)并糾正, 若不對(duì)個(gè)別的差異較大的ISR樣品進(jìn)行調(diào)查，則難以發(fā)現(xiàn)此種操作錯(cuò)誤，也會(huì)降低數(shù)據(jù)的科學(xué)性和客觀性。

7 內(nèi)源性物質(zhì)的檢測要求

因缺乏不含分析物的基質(zhì)和缺乏具有準(zhǔn)確已知分析物濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，內(nèi)源性化合物的定量分析而變得非常復(fù)雜。針對(duì)內(nèi)源性物質(zhì)特殊的要求，業(yè)內(nèi)也一直在嘗試科學(xué)可行的生物樣品分析方法。FDA/BMV/2018只提出了一些關(guān)于使用不含分析物的基質(zhì)或QCs制劑的一般建議，但是如何操作以及接受標(biāo)準(zhǔn)未做具體規(guī)定，操作性較差，而M10則彌補(bǔ)了這一缺陷，在內(nèi)源性物質(zhì)的生物樣品分析方法的建立和驗(yàn)證上，M10給出更加科學(xué)和具體的指導(dǎo)建議, 推薦了4種方法進(jìn)行內(nèi)源性物質(zhì)檢測方法：標(biāo)準(zhǔn)加入法、背景扣除法、替代基質(zhì)（簡化基質(zhì)、人造基質(zhì)或經(jīng)凈化的基質(zhì)）法和替代待測物法, 且對(duì)于質(zhì)控樣品以及標(biāo)準(zhǔn)曲線以及驗(yàn)證指標(biāo)和接受標(biāo)準(zhǔn)給出了建議，更具操作性，為進(jìn)一步明確內(nèi)源性物質(zhì)分析方法驗(yàn)證和樣本分析奠定了良好的基礎(chǔ)。

結(jié)語

正如前文所述，在過去30年生物分析實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)積累以及法規(guī)發(fā)展的背景下，生物分析監(jiān)管模式也在不斷演變，雖各大指導(dǎo)原則略有差異，但主體內(nèi)容越來越趨于一致，形成全球可接受并相對(duì)明確和一致的生物分析規(guī)范勢在必行，M10草案的發(fā)布必將加快這一步伐。

生物分析的全球標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程也必將對(duì)制藥行業(yè)產(chǎn)生積極的影響：對(duì)生物分析實(shí)驗(yàn)室，無需頻繁升級(jí)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和調(diào)整報(bào)告格式即可滿足不同區(qū)域的申報(bào)要求；對(duì)于制藥公司，促進(jìn)創(chuàng)新藥和仿制藥注冊(cè)數(shù)據(jù)的全球通用，可避免研發(fā)資源的重復(fù)浪費(fèi)，加快審評(píng)和上市速度；對(duì)于監(jiān)管部門，已核查實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)全球范圍互認(rèn)，可提高監(jiān)管效率，節(jié)約監(jiān)管成本。

利益沖突聲明：本文的觀點(diǎn)僅代表作者在該主題上的觀點(diǎn)和立場，本文作者與文中的任何組織機(jī)構(gòu)等均無利益關(guān)系或利益沖突。特此聲明。

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陽光德美生物分析專欄