干細(xì)胞用于組織再生中存在免疫排斥和畸胎瘤形成等問(wèn)題，但干細(xì)胞衍生的外泌體不會(huì)引起這些問(wèn)題。來(lái)自美國(guó)俄克拉荷馬大學(xué)毛傳斌課題組和浙江大學(xué)楊明英課題組的研究人員利用誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）成骨分化的外泌體，并用其修飾3D打印的鈦合金支架以實(shí)現(xiàn)無(wú)細(xì)胞的骨再生過(guò)程。該研究發(fā)表于Advanced Science雜志上（IF=15.84）。 

骨缺損由多種臨床疾病引起，例如骨感染、骨腫瘤、骨骼異常、先天畸形、骨折、無(wú)血管壞死、萎縮性骨不連、骨質(zhì)疏松和骨創(chuàng)傷。骨缺損傳統(tǒng)治療采用自體移植、同種異體移植治療。然而，這些療法有其自身的局限性。對(duì)于自體移植，受限于供體來(lái)源且與缺損部位匹配情況。而對(duì)于同種異體移植和異種移植，具有疾病傳播和免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)。干細(xì)胞的植入，例如人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）和人脂肪干細(xì)胞，被視為替代策略。然而，干細(xì)胞的植入面臨重大挑戰(zhàn)，包括免疫排斥、畸胎瘤形成和無(wú)方向的細(xì)胞分化。在干細(xì)胞上植入3D支架可能會(huì)引起免疫排斥，引起畸胎瘤形成，并導(dǎo)致無(wú)方向的細(xì)胞分化。因此，在不使用外部種子干細(xì)胞的情況下進(jìn)行骨再生（稱為無(wú)細(xì)胞再生）是解決這些源自細(xì)胞的問(wèn)題的有前途的方法。實(shí)際上，植入無(wú)細(xì)胞支架以促進(jìn)無(wú)細(xì)胞骨組織再生已成為避免這些問(wèn)題的一種有前途的策略。

為實(shí)現(xiàn)無(wú)細(xì)胞組織再生，無(wú)細(xì)胞3D支架應(yīng)具有可誘導(dǎo)成骨的生化和物理性質(zhì)?？赡艿纳€索之一是細(xì)胞分泌的外泌體，它們是納米顆粒（30-200納米），其脂質(zhì)雙層包裹信號(hào)分子，例如miRNA。源于干細(xì)胞的外泌體的免疫原性低于細(xì)胞本身，因?yàn)橥饷隗w含有的膜蛋白（例如主要的組織相容性復(fù)合物MHC）較少。外泌體可以長(zhǎng)時(shí)間保持其生物學(xué)活性。外泌體中的可溶性小分子，例如miRNA、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子，受到脂質(zhì)雙層的保護(hù)，并可以釋放到靶組織中。由于外泌體包含一系列遺傳信息，如miRNA一樣，可以指導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞間通訊。外泌體從細(xì)胞釋放時(shí)，可以通過(guò)粘附在受體細(xì)胞表面與受體細(xì)胞發(fā)生相互作用，并通過(guò)脂質(zhì)配體受體相互作用、內(nèi)吞攝入或與細(xì)胞膜融合而進(jìn)行通訊。 

由于MSC會(huì)將外泌體分泌到培養(yǎng)基中，因此MSC條件培養(yǎng)基將含有外泌體。這可能可以解釋已報(bào)道的發(fā)現(xiàn)，即使用MSC條件培養(yǎng)基也可以促進(jìn)組織再生。例如，以MSC為條件的培養(yǎng)基可以縮小梗死面積以治療心肌缺血，這種培養(yǎng)基可以增強(qiáng)腎源性上皮細(xì)胞的遷移和增殖，并增加腎小管細(xì)胞的體內(nèi)存活率。靜脈注射MSC衍生的外泌體可促進(jìn)神經(jīng)血管重塑。這些發(fā)現(xiàn)表明，包裹在外泌體中的生化物質(zhì)也可能在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)成骨。

圖：干細(xì)胞衍生的外泌體可進(jìn)行無(wú)細(xì)胞下的骨組織再生

因此，在這項(xiàng)研究里，研究人員鑒定了hMSCs分泌的成骨外泌體，并使用外泌體修飾3D打印的鈦合金支架（Ti支架）以實(shí)現(xiàn)無(wú)細(xì)胞的骨再生。具體而言，研究人員采用了在成骨分化培養(yǎng)基中預(yù)分化的hMSC衍生的外泌體，分別在0、4、10、15和20天（稱為EXO-D0、EXO-D4、EXO-D10、EXO-D15和EXO-D20）鑒定可在體外誘導(dǎo)hMSC向成骨細(xì)胞分化的外泌體。然后用成骨外泌體填充無(wú)細(xì)胞的3D打印Ti支架，以實(shí)現(xiàn)無(wú)細(xì)胞的骨再生。Ti支架用于支撐外泌體，因?yàn)門i具有生物相容性，不會(huì)引起與組織的免疫反應(yīng)，并支持骨細(xì)胞和礦化的骨基質(zhì)的附著而無(wú)任何介入。此外，Ti支架具有理想的性能，例如均勻的結(jié)構(gòu)、高強(qiáng)度、低剛度、高孔隙率、耐腐蝕性和高摩擦系數(shù)。 

研究人員使用實(shí)時(shí)PCR、免疫熒光染色、茜素紅染色和堿性磷酸酶（ALP）活性來(lái)證實(shí)在hMSC衍生的外泌體誘導(dǎo)下hMSC的成骨作用。無(wú)細(xì)胞的3D Ti支架也被用于在體內(nèi)誘導(dǎo)4和12周的骨組織再生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外泌體（EXO-D10和EXO-D15）攜帶有誘導(dǎo)分化的miRNA（例如Hsa-miR-146a-5p、Hsa-miR-503-5p、Hsa-miR-483-3p、Hsa-miR- 129‐5p、Hsa‐miR‐32‐5p、Hsa‐miR‐133a‐3p和Hsa‐miR‐204‐5p），因此可以在體外誘導(dǎo)hMSC的成骨分化，并使無(wú)細(xì)胞的Ti支架能夠通過(guò)激活PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)骨組織再生。因此，來(lái)自成骨細(xì)胞預(yù)分化hMSC的外泌體是無(wú)細(xì)胞骨組織再生的誘導(dǎo)劑。