編者按： 脊髓損傷（Spinal Cord Injury，SCI）是導(dǎo)致嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙的最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷之一，且發(fā)病率高。目前，這種疾病的確切致病機(jī)制尚不清楚，臨床上治療 SCI 及其后遺癥的方法很多，但均未取得滿(mǎn)意的療效。因此，脊髓損傷后的神經(jīng)修復(fù)仍然是醫(yī)學(xué)界急需解決的重大挑戰(zhàn)和臨床難題。已有的研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）移植可能是一種有效的治療脊髓損傷的方法，但具體的治療分子機(jī)制尚不清楚。
近期，山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院脊柱外科的王大川主任團(tuán)隊(duì)，分別在知名期刊：《Biomedicine & Pharmacotherapy》《Drug Design, Development and Therapy》陸續(xù)刊登了兩篇研究文章，利用 SCI 大鼠模型全面揭示了間充質(zhì)干細(xì)胞緩解大鼠脊髓損傷的分子機(jī)制，為后期開(kāi)發(fā)新的 SCI 治療策略，改善脊髓損傷后的功能恢復(fù)提供重要的理論支撐。定量蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)由諾禾致源提供。
其中，發(fā)表在期刊Biomedicine & Pharmacotherapy上的研究“Mesenchymal stem cell derived EVs mediate neuroprotection after spinal cord injury in rats via the microRNA-21-5p/FasL gene axis”，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的胞外囊泡（MSCs-EVs）能顯著改善 SCI 后大鼠的功能恢復(fù)，減輕損傷面積和細(xì)胞凋亡，并證明 MSCs-EVs 的神經(jīng)保護(hù)作用是通過(guò) miR-21-5p 來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這一發(fā)現(xiàn)不僅為 miR-21-5p 分子機(jī)制的研究提供了新的、重要的見(jiàn)解，而且為 SCI 治療干預(yù)新途徑的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。
1.MSCs-EVs 改善運(yùn)動(dòng)功能及抑制細(xì)胞凋亡將大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組（Sham）、SCI 組和 SCI+MSCs-EVs 組，研究脊髓損傷72h后MSCs-EVs的作用。BBB（Basso, Beattie, Bresnahan scores）評(píng)分顯示，SCI 后大鼠即刻出現(xiàn)右后肢運(yùn)動(dòng)功能喪失，且恢復(fù)緩慢。從 SCI 后7天開(kāi)始，MSCs-EVs 組的 BBB 評(píng)分開(kāi)始顯著高于 SCI 組，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而進(jìn)一步分離（圖1A）。與 SCI 組相比，SCI+MSCs-EVs 組凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2 和 Bax 的比值（Bax/Bcl-2）也顯著降低（圖1C,D）。表明 MSCs-EVs 可以在 SCI 后改善運(yùn)動(dòng)功能及抑制細(xì)胞凋亡。
圖1 MSCs-EVs 改善運(yùn)動(dòng)功能及抑制細(xì)胞凋亡
2、利用 TMT 定量蛋白質(zhì)組學(xué)篩選差異表達(dá)蛋白 利用 TMT 定量蛋白質(zhì)組學(xué)比較 SCI 組和 SCI+MSCs-EVs 組蛋白表達(dá)變化。共鑒定到883種蛋白質(zhì)，其中72種在 SCI 組和 SCI+MSCs-EVs 組之間呈現(xiàn)顯著差異。差異蛋白以火山圖（圖2A）和聚類(lèi)熱圖（圖2B）的形式呈現(xiàn)，并使用 GO、KEGG 和 COG 等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋?zhuān)瑥亩私膺@些差異蛋白質(zhì)的功能特性。研究發(fā)現(xiàn)部分差異蛋白質(zhì)與 SCI 顯著相關(guān)，如凋亡（Programmed cell death 6-interacting protein, Bcl2-associated athanogene-4）和炎癥（Annexin A1, Neutrophil antibiotic peptide NP-4）相關(guān)的蛋白。此結(jié)果與以前的研究一致，證明 MSCs-EVs 在脊髓修復(fù)中減輕炎癥并發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用（圖2C）。
圖2 差異表達(dá)蛋白分析
3、miR-21-5p 在 MSCs-EVs 及 SCI 后損傷脊髓組織中的表達(dá)分析利用 qRT-PCR 初步檢測(cè) miR-21-5p 在 SCI 后脊髓中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) miR-21-5p 在 SCI 后4h 和12h 顯著降低，SCI 后24 h、3d 和7d 顯著升高（圖3A）。miR-21-5p 是 MSCs-EVs 中表達(dá)最高的 miRNA 之一，與文獻(xiàn)報(bào)道一致（圖3B）。本研究利用 miR-21-5p 抑制劑及其陰性對(duì)照證實(shí) miR-21-5p 抑制劑顯著降低 MSCs-EVs 和損傷脊髓中 miR-21-5p 的表達(dá)（圖3C,D）。表明 miR-21-5p 抑制劑的轉(zhuǎn)染成功地降低了 miR-21-5p 在 MSC-EVs 中的表達(dá)水平，促進(jìn)了 SCI 的發(fā)生。
圖3 miR-21-5p 在 MSCs-EVs 及 SCI 后組織中的表達(dá)分析
4、EVs-miR-21-5p 下調(diào)促凋亡靶基因 FasL 的表達(dá)利用 miRNA 靶點(diǎn)分析工具（Targetscan和miBase）確定 miR-21-5p 介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的潛在靶點(diǎn)。發(fā)現(xiàn) miR-21-5p 與 FasL 基因的 3′UTR 具有互補(bǔ)性結(jié)合位點(diǎn)（圖4A）。使用熒光素酶報(bào)告基因分析 miR-21-5p 和 FasL 基因之間存在直接相互作用，發(fā)現(xiàn) FasL 野生型基因是 miR-21-5p 的直接靶基因（圖4B）。SCI 后， FasL 基因表達(dá)明顯升高，特別是12h（圖4C）。而 MSCs-EVs 處理后，F(xiàn)asL 基因表達(dá)會(huì)降低，但用 EVs-miR-21-5pinhibitors 處理則可以逆轉(zhuǎn)這種影響（圖4D），表明 EVs-miR-21-5p 下調(diào)促凋亡靶基因 FasL 的表達(dá)。
圖4 FasL 是 miR-21-5p 的靶基因
本文通過(guò)對(duì)大鼠 SCI 模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn) MSCs-EVs 能顯著改善 SCI 后大鼠的功能恢復(fù)，減輕損傷面積和細(xì)胞凋亡。利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)證明 MSCs-EVs 在脊髓修復(fù)中具有減輕炎癥并發(fā)揮抗凋亡作用。同時(shí)表明 MSC-21-5p/FasL 基因軸的調(diào)控可作為脊髓損傷及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療策略，為相關(guān)疾病的干預(yù)新途徑的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。 干細(xì)胞移植被認(rèn)為是具有廣泛應(yīng)用前景的 SCI 治療手段，而旁分泌作用似乎是干細(xì)胞移植治療 SCI 的主要作用之一。上篇研究證明了 MSCs-EVs 能顯著改善 SCI 大鼠的功能恢復(fù)，那么，在各種疾病模型中發(fā)揮重要保護(hù)作用的外泌體（Exo）又會(huì)對(duì) SCI 起到怎樣的治療效果呢？另一篇發(fā)表在期刊 Drug Design,Development and Therapy 上的文章題為：“Exosomes Derived From Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Inhibit Complement Activation In Rats With Spinal Cord Injury”，以大鼠 SCI 模型（假手術(shù)組（Sham）、SCI 組和 SCI+Exo（Exosomes）組）為研究對(duì)象，利用定量蛋白質(zhì)組等技術(shù)，深入探討了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體（BMSCs-Exo）作為無(wú)細(xì)胞療法對(duì)大鼠 SCI 的作用機(jī)制。證明了 BMSCs-Exo 通過(guò)抑制補(bǔ)體 mRNA 合成和釋放，以及與小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)合抑制 SCI 激活的 NF-κB，在脊髓損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，揭示了 BMSCs-Exo 緩解脊髓損傷的分子機(jī)理，有助于后期相應(yīng)診療方法的開(kāi)發(fā)。
1、補(bǔ)體系統(tǒng)的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析KEGG 分析顯示，Sham 組、SCI 組和 SCI+Exo 組在補(bǔ)體蛋白富集方面存在顯著差異（圖1）。SCI 組和 Sham 組間共鑒定到24個(gè)上調(diào)蛋白，這些上調(diào)蛋白主要為補(bǔ)體因子（Cfh、Cfp、 Cfb、C5、C6等），導(dǎo)致 SCI 組補(bǔ)體系統(tǒng)激活。與 SCI 組相比，SCI+Exo 組中發(fā)現(xiàn)7種下調(diào)蛋白，大鼠表現(xiàn)出下調(diào)補(bǔ)體系統(tǒng)某些成分的能力，導(dǎo)致補(bǔ)體系統(tǒng)抑制。表明 BMSCs-Exo 可以抑制 SCI 大鼠的補(bǔ)體系統(tǒng)激活。
圖1 KEGG 通路圖
2、BMSCs-Exo 減弱 SCI 誘導(dǎo)的補(bǔ)體 mRNA 表達(dá)增加用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)補(bǔ)體 mRNA 的表達(dá)，證實(shí)補(bǔ)體系統(tǒng)中有8種蛋白質(zhì)的相應(yīng)基因（圖2A）。與 Sham 組相比，SCI 組的補(bǔ)體 mRNA 顯著上調(diào)表達(dá)，而 BMSCs-Exo 處理后，SCI 誘導(dǎo)的補(bǔ)體 mRNA 水平顯著降低。
BMSCs-Exo 處理 SCI 大鼠72ｈ后，利用免疫組化的方法測(cè)定 SCI 補(bǔ)體系統(tǒng)中關(guān)鍵蛋白 C1q 的表達(dá)（圖2B），發(fā)現(xiàn) Sham 組脊髓組織中 C1q 陽(yáng)性細(xì)胞很少，而 SCI 組 C1q 陽(yáng)性細(xì)胞較多，BMSCs-Exo 處理后顯著降低了 SCI+Exo 組C1q 的表達(dá)。
圖2 BMSCs-Exo 減弱 SCI 誘導(dǎo)的補(bǔ)體增加
３、免疫熒光染色及 Western Blot 驗(yàn)證免疫熒光結(jié)果顯示，Iba-1 在所有 SCI 大鼠損傷部位附近均有大量表達(dá)（圖３）。在小膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)大量標(biāo)記的 BMSCs-Exo，其中大部分以小團(tuán)簇的形式在胞質(zhì)中聚集。
圖3 BMSCs-Exo 選擇性靶向受損脊髓中的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞
Western Blot 分析表明，SCI 會(huì)顯著增加磷酸化 NF-κB（p-p65）和磷酸化 IκBα（p-IκBα）水平（圖4），而 BMSCs-Exo 處理則會(huì)顯著降低 p-p65和p-IκBα 水平。
圖4 BMSCs-Exo 抑制 SCI 誘導(dǎo)的 NF-κB 活化
本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法評(píng)價(jià)了三組間補(bǔ)體系統(tǒng)的變化，并用 RT-PCR 驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，免疫熒光法檢測(cè)大鼠脊髓損傷后 BMSCs-Exo 的分布，Western Blot 檢測(cè) SCI 激活的 NF-κB 水平。最終表明BMSCs-Exo 可作為急性脊髓損傷的潛在治療手段，補(bǔ)體系統(tǒng)可能是改善脊髓損傷后恢復(fù)的重要新靶點(diǎn)。
小 編 總 結(jié)
兩篇研究論文均通過(guò) TMT 蛋白質(zhì)組學(xué)首先找到組間差異表達(dá)蛋白，隨后運(yùn)用 RT-PCR 在基因?qū)用骝?yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，結(jié)合免疫熒光、Western Blot 等方法增強(qiáng)文章說(shuō)服力。本文選題新穎，研究思路清晰，邏輯嚴(yán)謹(jǐn)，投入產(chǎn)出比高，值得廣大研究者借鑒。 |
