基本信息

論文題目：Exosomes released from tumor-associated macrophages transfer miRNAs that induce a Treg/Th17 cell imbalance in epithelial ovarian cancer

發(fā)表期刊：Cancer Immunology Research

發(fā)表時間：2018.11

影響因子：9.188

通訊作者：上海交大醫(yī)學院 汪希鵬教授、林盈盈博士

本文涉及的高通量技術(shù)：安捷倫miRNA芯片（由歐易生物提供服務(wù)）

研究背景

免疫微環(huán)境由腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）和T淋巴細胞組成，后者包括調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）和T細胞助手17細胞（Th17），免疫微環(huán)境對上皮性卵巢癌（Epithelial ovarian cancer，EOC）的發(fā)展具有重要作用。Treg/Th17細胞不平衡與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、腫瘤等多種疾病有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)TAMs能夠產(chǎn)生外泌體作用于微環(huán)境中毗鄰的細胞，但是EOC免疫微環(huán)境中外泌體及其轉(zhuǎn)運的miRNA的具體功能和作用機制仍是未知的。

研究內(nèi)容

基于TAMs細胞來源的外泌體miRNA芯片分析，作者發(fā)現(xiàn)了miR-29a-3p和miR-21-5p高表達。將兩種類型的miRNA mimics轉(zhuǎn)染到CD4+ T細胞，發(fā)現(xiàn)其抑制STAT3的表達，并造成Treg/Th17失衡。

結(jié)果表明，外泌體能夠調(diào)節(jié)TAMs細胞和T細胞的相互作用，產(chǎn)生的免疫抑制性微環(huán)境能夠促進EOC腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。分析TAMs細胞來源的外泌體及其相關(guān)miRNA能夠為EOC新的治療方法奠定基礎(chǔ)。

研究思路

研究結(jié)果

1.EOC患者組織中Treg/Th17發(fā)生了上調(diào)

選取124個EOC患者和26個良性卵巢腫瘤患者的卵巢組織樣本，通過免疫熒光檢驗發(fā)現(xiàn)與良性卵巢腫瘤患者相比，EOC患者的初期腫瘤組織和轉(zhuǎn)移性腹膜組織Treg/Th17均顯著升高。

圖1 |（E）EOC組織（n=124）和良性卵巢腫瘤組織（n=26）Treg/Th17的比率對比；EOC腹膜組織（n=15）和良性腹膜組織（n=6）Treg/Th17的比率對比

2.Treg/Th17失衡對卵巢腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響

利用ID8細胞系構(gòu)建轉(zhuǎn)移性卵巢癌C57BL/6模型，體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)Treg/Th17的比率升高能夠促進腫瘤細胞的生長，也能夠促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。

圖2 |（C）向C57BL/6小鼠腹腔內(nèi)注射ID8-Luc-pur細胞，用熒光成像系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)高Treg/Th17比率能夠顯著增加腫瘤的載量；（G）用伊紅（Hematoxylin-eosin）對腫瘤細胞進行染色，實時成像后發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞遍布整個腹腔

3.M2巨噬細胞產(chǎn)生的外泌體能夠誘導Treg/Th17失衡

誘導TAM分化成M1和M2兩種類型的巨噬細胞，未處理的巨噬細胞作為對照，分別與CD4+ T細胞進行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)TAMs細胞能夠誘導Treg/Th17的失衡。各自分離外泌體后再次與CD4+ T細胞進行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)TAMs細胞產(chǎn)生的外泌體能夠誘導Treg/Th17失衡。

圖3 |（B）三組中Treg/Th17的比率；（F）三組巨噬細胞分離得到的外泌體分別與CD4+ T細胞共培養(yǎng)三天，Th17和Treg細胞的比例通過流式細胞分析確定，并計算Treg/Th17

4.外泌體miRNAs通過靶向STAT3來誘導Tregs/Th17失衡

安捷倫miRNA芯片分析發(fā)現(xiàn)，M2巨噬細胞分泌的外泌體中有42個miRNAs發(fā)生了上調(diào)和10個miRNAs發(fā)生了下調(diào)，其中有五個上調(diào)miRNAs和一個下調(diào)miRNAs與T細胞分化有關(guān)。將miRNA mimics轉(zhuǎn)染到CD4+ T細胞，發(fā)現(xiàn)只有hsa-miR-29a-3p和hsa-miR-21-5p能夠改變Tregs/Th17。

Western blots和RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)過表達hsa-miR-29a-3p和hsa-miR-21-5p導致CD4+ T細胞的STAT3蛋白及其mRNA都發(fā)生下調(diào)。RT-PCR和流式細胞檢測分析進一步發(fā)現(xiàn)，細胞因子IL4、IL6和TNFα下調(diào)，抗炎細胞因子TGFβ和IL10上調(diào)。以上因素造成EOC腫瘤微環(huán)境失衡，最終導致腫瘤的發(fā)展。

圖4 |（A）THP-1和THP-1誘導得到的M2巨噬細胞分泌的外泌體中miRNA表達Heatmap圖；（B）和T細胞分化相關(guān)的miRNA；（D）將Hsa-miR-21-5p和hsa-miR-29a-3p mimics轉(zhuǎn)染到CD4+ T細胞，流式細胞檢測Th17和Treg細胞的比例，并計算Treg/Th17；（E）Western blot觀察Th17和Treg細胞STAT3蛋白表達量；（G）RT-PCR觀察Th17和Treg細胞STAT3 mRNA的表達量；（J-K）CD4+ T細胞受到hsa-miR-21-5p和hsa-miR-29a-3p mimic轉(zhuǎn)染或敲降后，Tregs細胞因子TGFβ、IL10和IL4以及Th17細胞因子TNFα和IL6的表達量

5.mmu-miR-29a-3p和mmu-miR-21-5p對卵巢腫瘤轉(zhuǎn)移的影響

向小鼠腹腔注射ID8-Luc-pur細胞，再次構(gòu)建轉(zhuǎn)移性卵巢癌C57BL/6模型，利用生物成像系統(tǒng)觀察腫瘤的生長情況，發(fā)現(xiàn)mmu-miR-21-5p-mimic和mmu-miR-29a-3p-mimic組腫瘤載量顯著增加。收集小鼠的腹膜、腸系膜和膈膜，利用實時成像技術(shù)觀察腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，發(fā)現(xiàn)mmu-miR-29a-3p和mmu-miR-21-5p能夠促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

圖5 |（C）向小鼠腹腔注射ID8-Luc-pur細胞，10周后利用生物成像系統(tǒng)檢測腫瘤細胞的熒光強度（cps）；（F）10周后小鼠腹腔的成像情況

6.Treg/Th17失衡與EOC分級和患者存活率有關(guān)

利用ROC曲線比較Treg/Th17在EOC患者中的靈敏性和特異性，Treg/Th17對臨床上EOC患者的總生存率具有很好的預(yù)測價值。利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析Treg/Th17和EOC患者的相互關(guān)系，得出Treg/Th17與EOC的組織學分級有關(guān)，并且是一個獨立的預(yù)后指標。

圖6 |（A）ROC曲線反映Treg/Th17比率在EOC患者中的靈敏性和特異性；（B）基于Treg/Th17不同比率（大于1.02和小于1.02）的EOC患者存活率情況；（C）TCGA數(shù)據(jù)庫中467個EOC患者的Treg/Th17和總生存率（OS）的關(guān)系；（D）TCGA數(shù)據(jù)庫中467個EOC患者miR-29a-3p和miR-21-5p表達量與OS的關(guān)系

總結(jié)

來自TAMs的外泌體向CD4+ T細胞轉(zhuǎn)運hsa-miR-29a-3p和hsa-miR-21-5p，通過直接靶向STAT3，導致Treg/Th17失衡，誘導EOC腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

圖7 | TAMs通過外泌體誘導EOC腫瘤發(fā)展的途徑

參考文獻

Zhou J, Li X, Wu X, et al., (2018). Exosomes released from tumor-associated macrophages transfer miRNAs that induce a Treg/Th17 cell imbalance in epithelial ovarian cancer. Cancer Immunology Research. doi: 10.1158/2326-6066.cir-17-0479