全轉(zhuǎn)錄組，指的是特定細(xì)胞在某一狀態(tài)下所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，包括了mRNA和非編碼RNA，例如lncRNA,miRNA,circRNA等。全轉(zhuǎn)錄組測序僅需構(gòu)建兩種文庫（small RNA文庫和去核糖體的鏈特異性文庫）便可同時分析4種RNA（miRNA，lncRNA，mRNA，circRNA）的信息。一方面節(jié)省樣本量，另一方面使用同一批次樣本提高研究結(jié)果可比性。

近些年，RNA研究領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)多種非編碼RNA（lncRNA , circRNA）可作為競爭性內(nèi)源RNA（competitive endougenous RNA，ceRNA）參與基因的表達(dá)調(diào)控，ceRNAs可以通過與mRNA競爭結(jié)合miRNA來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄本的翻譯。

全轉(zhuǎn)錄組分析便是針對一份樣品同時分析mRNA，lncRNA，circRNA和miRNA之間的聯(lián)合調(diào)控關(guān)系，全面構(gòu)建精細(xì)的RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，4種RNA兩兩間關(guān)聯(lián)分析和兩者以上ceRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控分析，不僅可以解釋生物學(xué)現(xiàn)象背后的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制，而且能夠縮小篩選范圍，挖掘關(guān)鍵基因。

全轉(zhuǎn)錄組分析的主要目的是了解不同類型轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物之間的行為和機制，具有分析內(nèi)容更加全面，可靠性更高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于免疫機制、疾病領(lǐng)域、發(fā)育進(jìn)化研究、致病機理和藥物靶標(biāo)等研究。

我們通常所說的轉(zhuǎn)錄組測序只能測到mRNA。但全轉(zhuǎn)錄組測序通過構(gòu)建兩個測序文庫（small RNA文庫和去核糖體的鏈特異性文庫，該文庫基礎(chǔ)上分析circRNA）可以測到以上4種RNA。

lncRNA靶基因預(yù)測主要有2種方式：cis作用靶基因預(yù)測和trans作用靶基因預(yù)測。

cis作用靶基因預(yù)測，基于co_located分析原理，認(rèn)為lncRNA的功能與其坐標(biāo)臨近的蛋白編碼基因相關(guān)，位于編碼蛋白上下游的lncRNA可能與啟動子或者共表達(dá)基因的其他順式作用元件有交集，從而在轉(zhuǎn)錄或者轉(zhuǎn)錄后水平對基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。判斷一個lncRNA具有cis調(diào)控作用通常要同時滿足以下幾個條件：1）附近的基因表達(dá)情況與其保持一致；2）該基因失活后會影響周圍基因的表達(dá)；3）會影響附近同一位點的基因表達(dá)。

trans作用靶基因預(yù)測，基于co_expressed分析，認(rèn)為lncRNA的功能跟編碼基因的位置沒有關(guān)系，而與其表達(dá)量具有相關(guān)性。也就是說，當(dāng)lncRNA與一些距離較遠(yuǎn)的基因在表達(dá)量上存在正相關(guān)或負(fù)相關(guān)的情況時，就可以通過樣本間lncRNA與蛋白編碼基因的表達(dá)量相關(guān)性分析或WGCNA共表達(dá)分析來預(yù)測其靶基因。lncRNA的trans作用靶基因預(yù)測只適合于樣本量大的情況，如果樣本量太少（6個以下），分析結(jié)果不可靠。

1、數(shù)據(jù)庫中沒有將sense的lncRNA去除，sense類型的lncRNA是與mRNA存在一定程度的overlap。

2、如果lncRNA與mRNA位置完全一致，需要考慮是否分別位于正鏈和負(fù)鏈，lncRNA與mRNA可能存在位于不同的鏈上，但堿基完全互補的情況。

lncRNA(長鏈非編碼RNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt,不編碼蛋白的RNA分子?；谄唇咏Y(jié)果，根據(jù)lncRNA的結(jié)構(gòu)特點以及不編碼蛋白的功能特點，設(shè)置一系列嚴(yán)格的篩選條件。通過以下5步的篩選,將篩選所得lncRNA作為最終的候選lncRNA集進(jìn)行后續(xù)分析。

篩選步驟：

step1: 對所有樣品拼接得到的轉(zhuǎn)錄本使用cuffcompare軟件進(jìn)行合并，選擇同時被兩種拼接軟件鑒定到，或者同時出現(xiàn)在至少兩個樣品中的轉(zhuǎn)錄本；

step2: 選擇轉(zhuǎn)錄本長度>=200bp；

step3: 按照轉(zhuǎn)錄本FPKM值對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行篩選

step4: 若該物種存在已知lncRNA數(shù)據(jù)，首先通過cuffcompare軟件，將前一步得到的轉(zhuǎn)錄本與已知lncRNA進(jìn)行比較，得到與已知lncRNA相同的轉(zhuǎn)錄本。這一部分轉(zhuǎn)錄本直接納入最終的lncRNA集，不再進(jìn)行后續(xù)篩選。之后，通過與該物種已知非lncRNA及非mRNA類型（rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, pre-miRNA, pseudogenes等）的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比較，篩除那些與以上已知轉(zhuǎn)錄本相似或相同的轉(zhuǎn)錄本。若無已知lncRNA數(shù)據(jù)，則直接進(jìn)行與該物種已知非lncRNA及非mRNA類型轉(zhuǎn)錄本的比較；

step5: 通過與已知mRNA進(jìn)行比較，并利用cuffcompare分析結(jié)果中class_code信息篩選候選lincRNA，intronic lncRNA, anti-sense lncRNA等類型的轉(zhuǎn)錄本用于后續(xù)定量分析。

長鏈非編碼rna的作用機制非常復(fù)雜，至今仍有許多未知領(lǐng)域。根據(jù)已有的研究，lncRNA的作用機制主要有以下幾種：

1、在編碼基因上游啟動子區(qū)發(fā)生轉(zhuǎn)錄，干擾下游基因的表達(dá)；

2、抑制RNA聚合酶II或者介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)以及組蛋白修飾，影響下游基因的表達(dá)；

3、與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補雙鏈，干擾mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；

4、與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補雙鏈，在Dicer酶的作用下產(chǎn)生內(nèi)源性siRNA；

5、與特定蛋白質(zhì)結(jié)合，lncRNA轉(zhuǎn)錄本可調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性；

6、作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體；

7、結(jié)合到特定蛋白質(zhì)上，改變該蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位；

8、作為小分子RNA(如miRNA、piRNA)的前體分子。

驗證方法：

1、表達(dá)量驗證，通過熒光定量驗證差異基因的表達(dá)水平，是否和測序結(jié)果一致。

2、原位雜交（FISH）首先看鎖定的lncRNA細(xì)胞的位置，再推斷它的功能。

3、功能缺失實驗：利用siRNA、shRNA、反義核酸等方法沉默lncRNA，觀察干預(yù)后對細(xì)胞增值、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、染色體等的影響，驗證lncRNA靶基因的表達(dá)情況。

4、功能獲得性實驗：構(gòu)建lncRNA過表達(dá)載體，觀察過表達(dá)lncRNA后對細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等的影響，驗證lncRNA靶基因的表達(dá)豐度。

5、過表達(dá)或敲除實驗，假如lncRNA定位到細(xì)胞核，缺失后發(fā)現(xiàn)預(yù)測的靶基因表達(dá)水平升高，推測lncRNA可能與轉(zhuǎn)錄因子（蛋白）結(jié)合抑制DNA的轉(zhuǎn)錄；或lncRNA定位于細(xì)胞質(zhì)中，過表達(dá)或缺失實驗發(fā)現(xiàn)一些蛋白活性升高或降低，推測lncRNA可能和一些蛋白結(jié)合發(fā)揮作用。

如何實施lncRNA與蛋白結(jié)合的驗證：設(shè)計探針利用免疫磁珠富集lncRNA，富集產(chǎn)物進(jìn)行l(wèi)ncRNA和蛋白解離，利用質(zhì)譜鑒定結(jié)合產(chǎn)物；若已知某個蛋白與RNA結(jié)合，可以采用抗體富集蛋白，產(chǎn)物進(jìn)行蛋白與RNA解離，對RNA進(jìn)行測序（RIP-seq技術(shù)）。

Q8

lncRNA具有廣泛的調(diào)控作用，不僅能夠直接調(diào)控DNA的結(jié)構(gòu)、RNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，而且具有miRNA結(jié)合位點，可以作為miRNAspong競爭性地結(jié)合miRNA，抑制miRNA對靶基因的調(diào)節(jié)作用，從而間接地調(diào)控基因表達(dá)。基于ceRNA理論，尋找擁有相同miRNA結(jié)合位點的lncRNA-gene pairs，構(gòu)建以lncRNA為連接、miRNA為核心、mRNA為靶標(biāo)的lncRNA–miRNA-gene pairs，構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

非編碼RNA中，circRNA也具有miRNA結(jié)合位點，可以作為miRNAspong競爭性地結(jié)合miRNA, 抑制miRNA對靶基因的調(diào)節(jié)作用，從而間接地調(diào)控基因表達(dá)?；赾eRNA理論，尋找擁有相同miRNA結(jié)合位點的circRNA-gene pairs，構(gòu)建以circRNA為連接、miRNA為核心、mRNA為靶標(biāo)的circRNA-miRNA-gene pairs，構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

在全轉(zhuǎn)錄組層面，利用ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示ncRNA調(diào)控基因表達(dá)新機制。