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Ct值是什么？ Ct值具有什么樣的作用？ Ct值的正常范圍是多少？ Ct值太大或者太小的原因？ Ct值是熒光定量PCR最重要的結(jié)果呈現(xiàn)形式。它被用于計算基因表達量差異或者基因拷貝數(shù)。那么熒光定量的Ct值多大可被認為是合理？如何保證Ct值的有效范圍呢？今天就讓小編來為大家解答這個問題。 Ct值是什么？ qPCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的熒光閾值時的所對應(yīng)的擴增循環(huán)數(shù)（Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。簡單講，Ct值就是qPCR中起始模板擴增達到一定產(chǎn)物量時，所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)。所謂“一定產(chǎn)物量”后續(xù)作進一步解釋。 Ct值有什么作用？ 1.指數(shù)擴增、模板量與Ct值的關(guān)系 理想情況下，qPCR中的基因經(jīng)過一定的循環(huán)數(shù)被指數(shù)擴增而積累，擴增循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物量之間的關(guān)系是：擴增產(chǎn)物量=起始模板量×（1+En）循環(huán)個數(shù)。然而qPCR反應(yīng)并不是一直處于理想情況下，當擴增產(chǎn)物量達到“一定產(chǎn)物量”時，此時循環(huán)個數(shù)為Ct值，處于指數(shù)擴增時期。Ct值與起始模板量的關(guān)系：模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。起始模板量濃度越高，Ct值越?。黄鹗寄０辶繚舛仍降?，Ct值越大。 2.擴增曲線、熒光閾值與一定產(chǎn)物量 qPCR擴增產(chǎn)物量是以熒光信號的形式直接呈現(xiàn)，也就是擴增曲線。在PCR早期，擴增處于理想情況下，循環(huán)數(shù)較少，產(chǎn)物積累少，產(chǎn)生熒光的水平不能與熒光本底背景明顯地區(qū)別，之后熒光的產(chǎn)生增加進入指數(shù)期?？梢栽?/span>PCR反應(yīng)剛處于指數(shù)期的某一點上來檢測PCR產(chǎn)物的量，以此作為“一定產(chǎn)物量”，并且由此來推斷模板最初的含量。因此，一定產(chǎn)物量對應(yīng)的熒光信號強度，也就是熒光閾值。
在PCR的后期，擴增曲線不再呈現(xiàn)指數(shù)擴增，進入線性期和平臺期。 3.Ct值的重現(xiàn)性 PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期，此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。 Ct值的范圍？ 1.擴增效率En PCR擴增效率是指聚合酶把待擴增基因轉(zhuǎn)變生成擴增子的效率。由1個DNA分子轉(zhuǎn)變生成2個DNA分子時的擴增效率為100%。擴增效率常用En表示。為了方便后續(xù)文章的分析，簡要介紹下影響擴增效率的因素。
2.Ct值的范圍 Ct值的范圍為15-35。Ct值小于15，認為擴增在基線期范圍內(nèi)，未達到熒光閾值。理想情況下，Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，也就是標準曲線。通過標準曲線，擴增效率為100%時，計算出基因單個拷貝數(shù)定量的Ct值在35左右，若大于35，理論上模板起始拷貝數(shù)小于1，可認為無意義。
對于不同的基因Ct范圍，因起始模板量中基因拷貝數(shù)和擴增效率不同，需做出該基因的標準曲線，計算出基因的線性檢測范圍。 3.Ct值的影響因素 由擴增循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物量之間的關(guān)系：擴增產(chǎn)物量=起始模板量×（1+En）循環(huán)個數(shù)，可以看出，在理想條件下，起始模板量和En會對Ct值產(chǎn)生影響。模板質(zhì)量或者擴增效率的差異會造成Ct值偏大或過小。 4.Ct值過大或過小 小翊威逼利誘了我公司技術(shù)部的牛牛們，總結(jié)出Ct值常見的兩類問題的原因和解決方法，以饗讀者。
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