Real Time PCR技術(shù)最早報(bào)告在1991年，是由日本人Hihuchi提出的。當(dāng)時(shí)他的想法就是想實(shí)時(shí)觀察PCR反應(yīng)的全過程，最終達(dá)到檢測(cè)樣品中的DNA量的目的。他使用了EB(溴乙錠)作為熒光標(biāo)記染料，利用了PCR反應(yīng)中的數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系，再結(jié)合加入標(biāo)準(zhǔn)品的方法，達(dá)到了對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量的目的。

1995年美國(guó)PE公司成功研制了TaqMan技術(shù)，1996年又推出了首臺(tái)Real Time PCR檢測(cè)系統(tǒng)，使Real Time PCR技術(shù)真正得以應(yīng)用和推廣。近年，Real Time PCR技術(shù)不斷完善，取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，由于其具有操作簡(jiǎn)單、快速方便、靈敏度高、重復(fù)性好、污染率低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)、藥物療效考核、基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究、基因檢測(cè)、病原體檢測(cè)、動(dòng)植物檢測(cè)、食品檢測(cè)等各種領(lǐng)域。

市面上常見的幾款熒光PCR機(jī)型。

市場(chǎng)主流熒光PCR機(jī)型

熒光實(shí)時(shí)定量PCR定量原理：

PCR每進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，DNA呈2倍的指數(shù)關(guān)系增長(zhǎng)，不久達(dá)到平臺(tái)期。起始DNA量越多擴(kuò)增產(chǎn)物量便越早達(dá)到檢出值，也就是擴(kuò)增曲線越早起峰。我們將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋進(jìn)行Real Time PCR，就會(huì)按照起始DNA量由多到少得順序等間隔得到一系列擴(kuò)增曲線。再由Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)值之間存在的線性關(guān)系，就可以制作成下圖標(biāo)示的標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知濃度的樣品與標(biāo)準(zhǔn)品相同，檢測(cè)未知樣品CT值，并將其代人標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以求出未知濃度樣品的起始模板量，這就是Real Time PCR的定量原理。

在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行， PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。

實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線圖

PCR的擴(kuò)增曲線實(shí)際上并不是一條標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是S形曲線。這是因?yàn)殡S著PCR循環(huán)數(shù)的增加，DNA聚合酶的失活，dNTP和引物的枯竭，反應(yīng)副產(chǎn)物焦磷酸對(duì)合成反應(yīng)的阻害等原因，致使PCR并非一直呈指數(shù)擴(kuò)增，而最終將進(jìn)入平臺(tái)期。

熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段 , 熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR 產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，因此應(yīng)選擇這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。

重要概念的定義：

1．  什么是基線？

基線就是擴(kuò)增曲線中的水平部分。

線性基線期為擴(kuò)展最初的10~15個(gè)循環(huán)，此時(shí)，PCR反應(yīng)處于起始階段，擴(kuò)增產(chǎn)物很少，所產(chǎn)生的熒光信號(hào)很低。

2. 什么是熒光閾值(Threshold)?

PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，即：Threshold = 10 SDcycle 3-15

3. 什么是CT值？

C代表Cycle，t代表threshold

Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。有實(shí)驗(yàn)證明Ct值大小與樣本中的原始拷貝數(shù)成反比關(guān)系。Ct值是實(shí)時(shí)熒光PCR的主要定量參數(shù)

4. Ct值與起始模板的關(guān)系？

每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中縱坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，橫坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

熒光定量PCR標(biāo)記檢測(cè)類型:

1.       內(nèi)摻式染: SYBR Green I

熒光嵌合法通常使用SYBR Green I。SYBR Green I是一種能夠結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。它與PCR合成的雙鏈DNA結(jié)合，在激發(fā)光照射下產(chǎn)生熒光，熒光染料結(jié)合到雙鏈DNA后熒光信號(hào)增加1000倍，通過熒光強(qiáng)度的檢測(cè)，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物量。

溶解曲線：

采用SYBR Green I熒光嵌合法檢測(cè)時(shí)，可以通過融解曲線分析，確認(rèn)PCR反應(yīng)的特異性。溶解曲線分析是在PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR反應(yīng)液的溫度漸漸升高，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)SYBR Green I的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化進(jìn)行的。起初由于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物呈雙鏈，具有較高的熒光信號(hào)強(qiáng)度，隨著溫度的漸漸升高，DNA雙鏈漸漸打開，嵌入DNA中的SYBR Green I數(shù)量減少，熒光信號(hào)強(qiáng)度就漸漸降低，當(dāng)雙鏈DNA解鏈一半時(shí)，熒光信號(hào)強(qiáng)度急劇下降，此時(shí)的溫度即融解溫度（Tm值），Tm值與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列有關(guān)，對(duì)于某一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其值是固定的。

 如果出現(xiàn)兩個(gè)或以上的峰型，說明有引物二聚體等非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生，需要對(duì)反應(yīng)  條件進(jìn)行優(yōu)化或重新設(shè)計(jì)引物。

優(yōu)點(diǎn)：成本較低，無(wú)須對(duì)引物或探針進(jìn)行特殊的熒光標(biāo)記，操作亦比較簡(jiǎn)單 ，適合于篩檢。

缺點(diǎn)：特異性不夠，染料分子會(huì)結(jié)合到非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈分子和引物二聚體中，使反應(yīng)體系中的熒光本底較高

2.       序列特異性探針:

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）：當(dāng)一個(gè)熒光基團(tuán)與一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)（可以淬滅前者的發(fā)射光譜）的距離鄰近至一定范圍時(shí)，就會(huì)發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移，淬滅基因會(huì)吸收熒光基團(tuán)在激發(fā)光作用下的激發(fā)熒光，從而使其發(fā)不出熒光。但如果熒光基團(tuán)一旦與淬滅基團(tuán)分開，淬滅作用即會(huì)消失。所以，利用核酸雜交和核酸水解所致熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)結(jié)合或分開的原理，建立各種實(shí)時(shí)熒光PCR。

a.       Taqman探針：

TaqMan Probe法是使用5’端帶有熒光物質(zhì)（如：FAM等），3’端帶有淬滅物質(zhì)（如：TAMRA等）的TaqMan探針進(jìn)行熒光檢測(cè)的方法。當(dāng)探針完整時(shí)，5’端的熒光物質(zhì)受到3’端的淬滅物質(zhì)的制約，不能檢出熒光。而當(dāng)TaqMan探針被分解后，5’端的熒光物質(zhì)便會(huì)游離出來(lái)，發(fā)出熒光。

當(dāng)PCR反應(yīng)液中加入熒光探針后，在PCR反應(yīng)的退火過程中，熒光探針便會(huì)和模板雜交，進(jìn)一步在PCR反應(yīng)的延伸過程中，DNA聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性可以分解與模板雜交的熒光探針，游離熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，通過檢測(cè)反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度，可以達(dá)到檢測(cè)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的，具體原理如下圖：

b.       TaqMan MGB 探針:

能分辨一個(gè)堿基的差別。