實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

通常我們會(huì)重點(diǎn)關(guān)注Ct值（Cycle threshold ，Ct），其含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

熒光化學(xué)

熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。其原理如下：

• TaqMan熒光探針：
  PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。
• SYBR熒光染料：
  在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
  熒光染料也稱DNA結(jié)合染料，目前主要使用的染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I能與DNA雙鏈的小溝特異性的結(jié)合，游離的SYBR Green I幾乎沒(méi)有熒光信號(hào)，但結(jié)合雙鏈DNA后，其熒光信號(hào)可呈數(shù)百倍的增加。隨PCR產(chǎn)物的增加，PCR產(chǎn)物與染料的結(jié)合量也增大，其熒光信號(hào)強(qiáng)度代表雙鏈DNA分子的數(shù)量。

不過(guò)，實(shí)驗(yàn)室常用的為SYBR Green I熒光染料。

SYBR Green I與雙鏈DNA結(jié)合后會(huì)發(fā)出綠色熒光。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理

擴(kuò)增曲線

在Real-time qPCR中，對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的檢測(cè)并記錄其熒光信號(hào)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)可以繪制成一條曲線，即為擴(kuò)增曲線。

熒光擴(kuò)增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。

在Real-time qPCR擴(kuò)增早期，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化，此時(shí)即為基線期。

PCR反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板，從而進(jìn)入“平臺(tái)期”。在該時(shí)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無(wú)線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出初始模板量。

只有在熒光信號(hào)的指數(shù)增長(zhǎng)期，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。

熒光閾值

PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)。通常熒光閾值都是Real-time qPCR儀器自動(dòng)設(shè)置，如無(wú)特殊情況，無(wú)需更改。

循環(huán)閾值

循環(huán)閾值 (Cycle threshold valve, Ct) 即Real-time qPCR擴(kuò)增過(guò)程中擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)，Ct值與熒光閾值有關(guān)。

一般Ct值位于指數(shù)增長(zhǎng)期的開(kāi)始階段，此時(shí)樣品間細(xì)小誤差尚未放大且擴(kuò)增效率也相對(duì)恒定，因此該Ct值具有極好的重復(fù)性，盡管平臺(tái)期的DNA拷貝數(shù)波動(dòng)很大，Ct值卻是相對(duì)固定的。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

• 設(shè)計(jì)qPCR引物

• 產(chǎn)物長(zhǎng)度在70-150bp之間；
• 產(chǎn)物GC含量在50-60%之間；
• 引物GC含量在40-60%之間；
• 應(yīng)避免引物中有4個(gè)以上連續(xù)重復(fù)的堿基，推薦引物末端為G或C；
• 建議引物跨越一個(gè)內(nèi)含子，避免擴(kuò)增到基因組DNA；
• 通過(guò)blast，確定目標(biāo)片段的特異性；

• 引物設(shè)計(jì)的網(wǎng)站
  以上說(shuō)了這么多引物設(shè)計(jì)的原則，實(shí)際上有一些好用的網(wǎng)站，基本上考慮了qPCR引物設(shè)計(jì)的各種原則。這里我推薦下面的引物設(shè)計(jì)在線網(wǎng)站。

https://quantprime.mpimp-golm./
該網(wǎng)站的優(yōu)點(diǎn)：

• 可以通過(guò)基因ID批量設(shè)計(jì)qPCR引物，方便到可以將排名第一的引物直接導(dǎo)出復(fù)制粘貼到引物合成訂單中，問(wèn)題不大，如果不放心可以大致看一下是否符合上述的引物設(shè)計(jì)原則。
• 大多數(shù)物種包括擬南芥，水稻，小麥等，甚至只要在ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)有的物種基本上都可以通過(guò)ID設(shè)計(jì)引物。

用了之后發(fā)現(xiàn)是真香……

傻瓜式無(wú)腦操作。提交信息之后，該忙忙，忙完回來(lái)差不多就可以設(shè)計(jì)好了。何必耗費(fèi)時(shí)間去一個(gè)一個(gè)弄。

下面是大致步驟，隨便拿兩個(gè)基因來(lái)做示例。

稍等片刻即可。

這就是最終輸出的結(jié)果，驚不驚喜，意不意外。

詳細(xì)的使用說(shuō)明可參考網(wǎng)站提供的手冊(cè)。

需要設(shè)置空白對(duì)照NTC

目的有三：

• 檢測(cè)引物二聚體
  通常75℃的峰為引物二聚體，此時(shí)若樣品孔中出現(xiàn)除主峰之外的75℃峰，則影響不大。
• 檢測(cè)是否有非特異性擴(kuò)增
• 是否存在污染

避免污染的注意事項(xiàng)：

• 使用PCR專用水；
• 戴手套；
• 專用移液器；
• 75%乙醇噴洗操作臺(tái)，超凈臺(tái)最佳；

RNA質(zhì)控

使用高純度（不含DNA，蛋白質(zhì)和抑制劑）和高完整度（RNA無(wú)降解）的RNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室整個(gè)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)流程中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。

需要注意的是：RNA的純度和完整度是不相關(guān)的，需要同時(shí)嚴(yán)格控制。

在RNA質(zhì)控的過(guò)程中，只檢測(cè)RNA濃度（控制OD比值）就認(rèn)為RNA可以進(jìn)行后續(xù)定量是錯(cuò)誤的認(rèn)識(shí)；在測(cè)定濃度（純度）的同時(shí)，必須經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)RNA的完整度。只有兩者均嚴(yán)格滿足要求，方可進(jìn)行后續(xù)定量操作。

定量方法

測(cè)定引物擴(kuò)增效率——制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
配置具濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，利用引物進(jìn)行擴(kuò)增，計(jì)算每個(gè)濃度樣品的平均Ct值，通過(guò)濃度梯度的log值對(duì)Ct值作圖。

引物擴(kuò)增效率的要求：

• 引物擴(kuò)增效率在90-110%之間；
• 標(biāo)準(zhǔn)曲線R2>0.98；
• Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)<0.2；

幾點(diǎn)注意事項(xiàng)：

• 常說(shuō)的Ct值=Cq值；
• 無(wú)論內(nèi)參基因還是目的基因，Ct值推薦在15-35之間，超過(guò)35時(shí)重復(fù)性就會(huì)很差；
• 配置的混合mix（定量SYBR mix，水，引物等）不得二次使用；
• 可以PCR產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品，10μL稀釋到100μL；
• 模板量應(yīng)避免小于3μL，可計(jì)算合適濃度每個(gè)體系按5μL量加模板；

排板問(wèn)題

• 如果需要多板布局，則每板必須設(shè)置一組相同的樣品用以消除誤差；
• 可提前排板，方便后續(xù)計(jì)算。

定量數(shù)據(jù)處理

△△Ct法計(jì)算原理及推導(dǎo)過(guò)程

最近做了一個(gè)簡(jiǎn)單的excel模板，用以處理qPCR數(shù)據(jù)。

黃色區(qū)域的數(shù)據(jù)粘貼在GraphPad即可出圖。還挺方便的。