據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球有7000多種罕見病，其中80%的罕見病是單基因遺傳病。罕見病的疾病總數(shù)在臨床基因治療實(shí)驗(yàn)適應(yīng)癥分析中占了總體疾病類型8.7%。但由于其本身的發(fā)病率極低，單一病癥的患者少，且在某些情況下，顯性基因性狀表達(dá)極其輕微，甚至臨床不能查出，導(dǎo)致罕見病的發(fā)現(xiàn)、研究與治療變得較為困難，其中廣為我們所知的單基因疾病，就有諸如：唐氏綜合癥，軟骨癥，血友病A等。

數(shù)據(jù)來源：J Gene Med 、浙商證券研究所

01

普遍的單基因疾病治療方法

雖然單基因疾病難以預(yù)防醫(yī)治，但是我們在單基因疾病的治療方面也并非束手無策。

對于多種累及神經(jīng)系統(tǒng)的代謝性遺傳病，如苯丙酮尿癥、楓糖尿癥、胱氨酸尿癥等，一般采用飲食治療。通過按不同疾病制定不同食譜,限制底物或前驅(qū)物的攝人量,如苯丙酮尿癥患兒需食用特殊配制的低或無苯丙氨酸奶粉,盡量減少苯丙氨酸攝入,肝豆?fàn)詈俗冃曰颊卟扇〉湾H飲食減少銅的攝人以盡量減少銅在機(jī)體的沉積。

對于一些由基因突變導(dǎo)致器官畸形的疾病，則采用手術(shù)治療，如球形紅細(xì)胞增多癥，由于遺傳缺陷使患者的紅細(xì)胞膜滲透脆性明顯增高，紅細(xì)胞呈球形，這種紅細(xì)胞在通過脾臟的脾竇時極易被破壞而引起溶血性貧血，則可以實(shí)施脾切除術(shù)，脾切除后雖然不能改變紅細(xì)胞的異常形態(tài)，但卻可以延長紅細(xì)胞的壽命，獲得治療效果。對于多指、兔唇及外生殖器畸形等，同樣可通過手術(shù)矯治。

對于一些由于體內(nèi)激素失調(diào)的病變，則會使用藥物治療。從而改善患者的病情，減少痛苦。主要是對癥治療，如服止痛劑以減輕病員疼痛。還可以改善機(jī)體代謝，如肝豆?fàn)詈俗冃裕饕求w內(nèi)銅代謝障礙，使血內(nèi)銅的水平升高，導(dǎo)致胎兒畸形?？梢苑么龠M(jìn)銅排泄的藥物，同時限制食用含銅的食物，以保持體內(nèi)銅的正常水平，而達(dá)到良好的治療效果。還有些病如先天性低免疫球蛋白血癥，可以注射免疫球蛋白制劑，以達(dá)到治療的目的。

但是這些方法對于單基因疾病的治療，都只是治標(biāo)不治本，按照現(xiàn)今的技術(shù)唯有基因編輯才能用于從根本上治療單基因疾病。

02

DNA的構(gòu)成及DNA與單基因疾病的聯(lián)系

 圖源：《楊輝博士采訪稿》

眾所周知，基因就是有遺傳效應(yīng)的DNA片段。人類的DNA由31億多個堿基對組成，這31億多個堿基對則是由ATCG4種堿基有機(jī)地排列組合組成。

 每個人體內(nèi)含有20000到25000個基因，雖然由于遺傳體系的不同，導(dǎo)致大家各有不同，但就算我們在人群中任意找出兩個人對比他們的基因，我們都會發(fā)現(xiàn)這倆者間基因的差別微乎其微，只有不足1%的差別。而若是將這倆者的基因與黑猩猩相比較，我們會驚訝的發(fā)現(xiàn)，在基因組上黑猩猩與人類的差距也僅在1%多一些，可見微小的差距也會導(dǎo)致基因所表達(dá)的性狀大有不同。

 而單基因疾病的發(fā)生則是由于一個堿基的變化，一個堿基完全可以導(dǎo)致基因功能的改變或者缺失而形成疾病。而幾乎有50%的單基因的遺傳病，都是由于一個堿基變化導(dǎo)致的。

 所以，無數(shù)代科學(xué)家就在考慮一個問題——是否能把這個變異的堿基進(jìn)行修正？但實(shí)際，這樣的研究是很難的。

03

基因編輯過程中遇到的問題

  圖源：《楊輝博士采訪稿》

首先，最大的難點(diǎn)在于如何找到這個變異的堿基？人類的身體中含有20000-25000個基因，而構(gòu)成這些基因的堿基數(shù)則更多，有將近31億。如何精準(zhǔn)的將錯誤的堿基精準(zhǔn)的選取出來，成為基因編輯過程中第一個難坎。

緊接著，科學(xué)家們在找到對應(yīng)變異堿基后，如何保證在剪切的過程中不破壞或者改變其他基因，而引發(fā)不良后果？

最后，則是如何在修復(fù)步驟中，獲取那個正確的模板？獲取后，又如何通過該模板對基因進(jìn)行修復(fù)？這成為了難倒科學(xué)家們的最后一大問題。

04

基因編輯的發(fā)展歷史

 圖源：網(wǎng)絡(luò)

基因編輯技術(shù)的研發(fā)起源于上世紀(jì)70年代，那時試管嬰兒剛剛興起，MIT的Rudolf Jaenisch受其啟發(fā)，通過直接改變小鼠的受精卵，來觀察成體小鼠是否會攜帶這個基因的突變。

他將病毒的DNA直接注射到受精卵中，然后移入到小鼠媽媽體內(nèi)。過了三周之后他獲得了小鼠，進(jìn)行基因鑒定，他發(fā)現(xiàn)確實(shí)所有小鼠的細(xì)胞都帶有這個病毒的DNA，而且這個DNA具有遺傳性，小鼠的后代也都帶有這個DNA。 

遺憾的是，Rudolf Jaenisc的小鼠實(shí)驗(yàn)中，病毒插入到基因組的方式是一個隨機(jī)插入，而不是定點(diǎn)插入。由于隨機(jī)插入有可能造成傷害，很難達(dá)到最好的效果。因此，嚴(yán)格意義上來說，這次小鼠實(shí)驗(yàn)雖然不算失敗，但也不足以算基因編輯。

胚胎操作 

圖源：《楊輝博士采訪稿》

但也正是從Rudolf Jaenisc這一次嘗試開始，基因編輯的研究走上了正途。

 十幾年之后，美國科學(xué)家馬里奧·卡佩奇（MarioCapecchi－鹽湖城猶他大學(xué)）和奧利弗·史密斯（Oliver Smithies—美國北卡羅萊納州大學(xué)）和英國馬丁·埃文斯（Martin Evans—英國加的夫大學(xué)）真正實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)插入式的基因編輯，他們也因此分別獲得了2007年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。

在那之后的20多年，基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)了真正的發(fā)展，到2012年已經(jīng)發(fā)展到第三代，在CRISPR-Cas9的技術(shù)產(chǎn)生后，基因編輯才能稱得上是每個實(shí)驗(yàn)室都可以操作的技術(shù)。

圖源：Mazhar Adil,NATURE COMMUNICATIONS,2018

在CRISPR/Cas9自問世以來，其脫靶風(fēng)險就一直備受科研人員的關(guān)注，因?yàn)槿绻麑RISPR/Cas9及其衍生工具用于臨床的話，脫靶效應(yīng)可能會引起包括癌癥在內(nèi)的很多種副作用。

為了減少CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)帶來的副作用，目前醫(yī)學(xué)界能做的就是提升檢測脫靶效應(yīng)的精度，就在大家因?yàn)槊摪袡z測技術(shù)精度不夠，而在CRISPR/Cas9的臨床使用上極為小心謹(jǐn)慎時，2019年3月1日，一篇題為“Cytosine base editor generates substantialoff-target single-nucleotide variants in mouse embryos”的研究論文在Science發(fā)表。緊接著2019年6月10日，Nature又在線發(fā)表了一篇題為“Off-target RNA mutation induced by DNA baseediting and its elimination by mutagenesis”的研究論文。一時間，這兩篇論文在CRISPR/Cas9的脫靶檢測領(lǐng)域一石激起千層浪。

那么，這兩篇高質(zhì)量的研究論文到底出自何方神圣呢？我國中科院神經(jīng)科學(xué)研究所的楊輝研究員以及他的團(tuán)隊(duì)走入了公眾的視線。

05

研究來自年輕的中國科學(xué)家

圖源：網(wǎng)絡(luò)

楊輝研究員，1985年8月生，博士，研究員。

現(xiàn)任中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院神經(jīng)科學(xué)研究所靈長類疾病模型研究組組長。2003-2007年就讀于上海交通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，獲生物技術(shù)學(xué)士學(xué)位。

 2007-2012年就讀于中科院上海分院生化細(xì)胞所李勁松研究組，獲發(fā)育生物學(xué)博士學(xué)位。

 2012-2013年在麻省理工Whitehead研究所 Rudolf Jaenisch 研究組從事博士后研究工作。

2014年，回國后任中科院神經(jīng)科學(xué)研究所研究員和靈長類疾病模型研究組組長。

他的研究興趣主要在于基因編輯技術(shù)的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究，近年來他的課題組在CRISPR構(gòu)建基因修飾動物、CRISPR介導(dǎo)的基因治療以及CRISPR的應(yīng)用拓展等方面取得了突出成績。

他的研究成果先后刊發(fā)在Cell、Nature、NatureNeuroscience、Developmental Cell、Cell Research等國際頂尖學(xué)術(shù)刊物上，論文被引3000余次。

楊輝研究員是國家青千入選者、國家優(yōu)秀青年科學(xué)基金項(xiàng)目、上海市青年拔尖人才計(jì)劃等獲得者，現(xiàn)任國家重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)“細(xì)胞編程與重編程異常致配子/胚胎源性疾病的分子機(jī)制”課題負(fù)責(zé)人，中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)、科技部863項(xiàng)目、上海市科學(xué)技術(shù)委員會“非人靈長類新型基因編輯技術(shù)與腦疾病動物模型”課題骨干。

06

“GOTI”脫靶檢測技術(shù)的誕生

楊輝博士是中科院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）最年輕的研究員，但其實(shí)他并不滿足于當(dāng)下的狀態(tài)，楊輝研究員和他的團(tuán)隊(duì)開始了對于提高脫靶檢測技術(shù)精度的研究。

為了提高檢測脫靶效應(yīng)的精度，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，楊輝團(tuán)隊(duì)設(shè)立下了以下要求：

1、通過極為嚴(yán)格的對照組來確定基因突變的位點(diǎn);

2、為了檢測不依賴于sgRNA的隨機(jī)突變，使用基于單細(xì)胞全基因組測序。

實(shí)驗(yàn)中，研究組與合作者建立了一種名叫“GOTI”的脫靶檢測技術(shù)——在小鼠受精卵分裂到二細(xì)胞期的時候，編輯一個卵裂球，并使用紅色熒光蛋白將其標(biāo)記。當(dāng)小鼠胚胎發(fā)育到14.5天時，將整個小鼠胚胎消化成為單細(xì)胞，利用流式細(xì)胞分選技術(shù)基于紅色熒光蛋白，分選出基因編輯細(xì)胞和沒有基因編輯細(xì)胞，再進(jìn)行全基因組測序比較兩組差異。這樣不僅避免了單細(xì)胞體外擴(kuò)增帶來的噪音問題，同時由于實(shí)驗(yàn)組和對照組來自同一枚受精卵，理論上基因背景完全一致，因此直接比對兩組細(xì)胞的基因組，差異性就基本可以認(rèn)定為是基因編輯工具造成的。

楊輝團(tuán)隊(duì)還通過引入突變的方法，對兩種DNA單堿基編輯器的胞嘧啶脫氨酶和腺嘌呤脫氨酶分別進(jìn)行了優(yōu)化，最終獲得了3種高保真度的BE3突變體，均能夠完全消除RNA脫靶并維持DNA編輯活性的高精度單堿基編輯工具。與此同時，針對ABE系統(tǒng)，楊輝團(tuán)隊(duì)也根據(jù)降低脫氨酶TadA*的RNA結(jié)合活性思路進(jìn)行點(diǎn)突，在降低RNA脫靶現(xiàn)象的同時，維持了其在DNA上的編輯活性。

圖源：NATURE

此外，楊輝團(tuán)隊(duì)開發(fā)的ABE（F148A）突變體還能夠縮小基因編輯窗口，協(xié)助實(shí)現(xiàn)更加精準(zhǔn)的DNA編輯，該項(xiàng)技術(shù)在特異性和精確性上超越了ABE7.10。據(jù)了解，該突變體有望在未來成為一種更加安全、更加精準(zhǔn)的基因編輯工具，并完全應(yīng)用到臨床治療中。