生物醫(yī)學(xué)科研實驗,互助你我。今天,我們給大家?guī)淼氖茄芯啃盘柾?,常?guī)實驗WB,其常見問題的分析。 1. 沒有足夠的一抗或二抗結(jié)合目標蛋白 適當?shù)奶岣呖贵w的稀釋比例,或者延長4度孵育時間 2. 抗原量不足或者蛋白樣品降解 適當?shù)奶岣呱蠘恿浚蛘弑M量使用新鮮的樣本組織。并且加入蛋白酶抑制劑 3. 轉(zhuǎn)膜不充分 使用可逆染色劑例如麗春紅S檢測轉(zhuǎn)膜效果,檢查轉(zhuǎn)膜操作是否正確。PVDF膜需預(yù)先浸在甲醇中,然后浸到轉(zhuǎn)移緩沖液中。 4. 過度封閉使目標蛋白不能顯色 代替5% 脫脂奶粉,使用含0.5% 脫脂奶粉或無脫脂奶粉的抗體稀釋液,或更換封閉劑,減少封閉時間。 5.一抗不識別檢測物種的蛋白 參照說明書,比對免疫原序列和蛋白序列以確??贵w和目的蛋白會發(fā)生反應(yīng),設(shè)置陽性對照。 6. 組織中目的蛋白含量低 濃縮使信號最大化(例如檢測核蛋白要用核裂解物)。 7. 洗膜過度 勿過度洗膜 8. 二抗受疊氮鈉抑制 避免疊氮鈉和HRP標記抗體一起使用。如果一抗中含有疊氮鈉,一抗完后洗膜充分 9. 檢測試劑盒過期和底物失活 使用新鮮的底物。 1. 未進行非特異性封閉或封閉不充分:延長封閉時間,考慮更換合適的封閉劑 2. 一抗?jié)舛冗^高:稀釋抗體至合適濃度,以更高稀釋度抗體孵育更長時間(耗時長但特異性結(jié)合最好)。 3.抗體孵育溫度過高:4°C孵育。 4.一抗或二抗與封閉劑有交叉反應(yīng):在孵育和洗滌液中加入溫和去污劑如吐溫-20。脫脂奶粉含有酪蛋白,該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白,會結(jié)合磷酸化特異性抗體而易產(chǎn)生高背景。使用BSA代替奶粉作為封閉劑 5. 未結(jié)合蛋白質(zhì)洗滌不充分:增加洗滌次數(shù) 6. 膜的選擇導(dǎo)致的高背景:NC膜比PVDF膜背景低 7. 膜干燥:在孵育過程中防止膜變干,在任何步驟都保證膜有充分的反應(yīng)液,放入攪拌子不斷攪動或輕輕振蕩使膜浸在溶液中,避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象。 1. 體內(nèi)表達的蛋白樣本具有多種修飾形式如乙?;⒓谆?、烷基化、磷酸化、糖基化等:查閱文獻,使用試劑使樣品去磷酸化、去糖基化來驗證翻譯后的修飾。 2. 蛋白樣本降解(蛋白質(zhì)分子量降低):在樣品緩沖液中加入足夠的蛋白酶抑制劑 3. 檢測到未經(jīng)報道過的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而結(jié)構(gòu)不同的蛋白:查閱其它文獻報道,或BLAST搜尋,使用說明書推薦的細胞株或組織。 4. 一抗?jié)舛冗^高,高濃度時常出現(xiàn)多條蛋白帶:降低抗體濃度和/或孵育時間。 5. 二抗?jié)舛冗^高,高濃度產(chǎn)生非特異性結(jié)合:降低抗體濃度,增加二抗對照(不加一抗) 6. 條帶為非特異性條帶:應(yīng)用封閉多肽來區(qū)分特異性和非特異性條帶,只有特異性條帶能被封閉從而消失。 7. 靶蛋白形成多聚體:SDS-PAGE電泳上樣前,煮沸10分鐘而不是5分鐘,使蛋白質(zhì)解聚。 |
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