一区二区三区日韩精品-日韩经典一区二区三区-五月激情综合丁香婷婷-欧美精品中文字幕专区

分享

WB常見問題解答

 生物_醫(yī)藥_科研 2019-02-23
導(dǎo)讀

生物醫(yī)學(xué)科研實驗,互助你我。今天,我們給大家?guī)淼氖茄芯啃盘柾?,常?guī)實驗WB,其常見問題的分析。


01
class
無信號

1. 沒有足夠的一抗或二抗結(jié)合目標蛋白

    適當?shù)奶岣呖贵w的稀釋比例,或者延長4度孵育時間

2. 抗原量不足或者蛋白樣品降解

適當?shù)奶岣呱蠘恿浚蛘弑M量使用新鮮的樣本組織。并且加入蛋白酶抑制劑

3. 轉(zhuǎn)膜不充分

使用可逆染色劑例如麗春紅S檢測轉(zhuǎn)膜效果,檢查轉(zhuǎn)膜操作是否正確。PVDF膜需預(yù)先浸在甲醇中,然后浸到轉(zhuǎn)移緩沖液中。

4. 過度封閉使目標蛋白不能顯色

代替5% 脫脂奶粉,使用含0.5% 脫脂奶粉或無脫脂奶粉的抗體稀釋液,或更換封閉劑,減少封閉時間。

5.一抗不識別檢測物種的蛋白

參照說明書,比對免疫原序列和蛋白序列以確??贵w和目的蛋白會發(fā)生反應(yīng),設(shè)置陽性對照。

6. 組織中目的蛋白含量低

濃縮使信號最大化(例如檢測核蛋白要用核裂解物)。

7. 洗膜過度

勿過度洗膜

8. 二抗受疊氮鈉抑制

避免疊氮鈉和HRP標記抗體一起使用。如果一抗中含有疊氮鈉,一抗完后洗膜充分

9. 檢測試劑盒過期和底物失活

使用新鮮的底物。

02
class
背景高

1. 未進行非特異性封閉或封閉不充分:延長封閉時間,考慮更換合適的封閉劑

2. 一抗?jié)舛冗^高:稀釋抗體至合適濃度,以更高稀釋度抗體孵育更長時間(耗時長但特異性結(jié)合最好)。

3.抗體孵育溫度過高:4°C孵育。

4.一抗或二抗與封閉劑有交叉反應(yīng):在孵育和洗滌液中加入溫和去污劑如吐溫-20。脫脂奶粉含有酪蛋白,該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白,會結(jié)合磷酸化特異性抗體而易產(chǎn)生高背景。使用BSA代替奶粉作為封閉劑

5. 未結(jié)合蛋白質(zhì)洗滌不充分:增加洗滌次數(shù)

6. 膜的選擇導(dǎo)致的高背景:NC膜比PVDF膜背景低

7. 膜干燥:在孵育過程中防止膜變干,在任何步驟都保證膜有充分的反應(yīng)液,放入攪拌子不斷攪動或輕輕振蕩使膜浸在溶液中,避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象。

03
class
多帶現(xiàn)象

1. 體內(nèi)表達的蛋白樣本具有多種修飾形式如乙?;⒓谆?、烷基化、磷酸化、糖基化等:查閱文獻,使用試劑使樣品去磷酸化、去糖基化來驗證翻譯后的修飾。

2. 蛋白樣本降解(蛋白質(zhì)分子量降低):在樣品緩沖液中加入足夠的蛋白酶抑制劑

3. 檢測到未經(jīng)報道過的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而結(jié)構(gòu)不同的蛋白:查閱其它文獻報道,或BLAST搜尋,使用說明書推薦的細胞株或組織。

4. 一抗?jié)舛冗^高,高濃度時常出現(xiàn)多條蛋白帶:降低抗體濃度和/或孵育時間。

5. 二抗?jié)舛冗^高,高濃度產(chǎn)生非特異性結(jié)合:降低抗體濃度,增加二抗對照(不加一抗)

6. 條帶為非特異性條帶:應(yīng)用封閉多肽來區(qū)分特異性和非特異性條帶,只有特異性條帶能被封閉從而消失。

7. 靶蛋白形成多聚體:SDS-PAGE電泳上樣前,煮沸10分鐘而不是5分鐘,使蛋白質(zhì)解聚。

04
class
其他
“微笑”條帶:1.遷移過快、2.電泳溫度過高(改變了pH值和遷移速度):降低遷移速度或低溫電泳(冷庫或冰上)。

    本站是提供個人知識管理的網(wǎng)絡(luò)存儲空間,所有內(nèi)容均由用戶發(fā)布,不代表本站觀點。請注意甄別內(nèi)容中的聯(lián)系方式、誘導(dǎo)購買等信息,謹防詐騙。如發(fā)現(xiàn)有害或侵權(quán)內(nèi)容,請點擊一鍵舉報。
    轉(zhuǎn)藏 分享 獻花(0

    0條評論

    發(fā)表

    請遵守用戶 評論公約

    類似文章 更多

    久草国产精品一区二区| 国产成人亚洲欧美二区综| 丰满少妇被猛烈插入在线观看| 隔壁的日本人妻中文字幕版| 欧美国产日本免费不卡| 日韩一区二区三区有码| 搡老妇女老熟女一区二区| 老熟妇2久久国内精品| 亚洲欧美日本国产不卡| 麻豆91成人国产在线观看| 日本欧美一区二区三区就| 日本午夜乱色视频在线观看| 不卡一区二区在线视频| 日韩欧美高清国内精品| 欧美色欧美亚洲日在线| 中文字幕人妻综合一区二区| 国产又色又爽又黄又免费| 伊人久久青草地综合婷婷| 国产午夜福利在线观看精品| 蜜臀人妻一区二区三区| 日本一级特黄大片国产| 黑鬼糟蹋少妇资源在线观看| 性感少妇无套内射在线视频| 日韩1区二区三区麻豆| 欧美一区二区黑人在线| 爱草草在线观看免费视频| 青青操在线视频精品视频| 好吊妞在线免费观看视频| 国产精品午夜福利免费阅读| 久久精品久久精品中文字幕| 国产又粗又长又大高潮视频| 色综合视频一区二区观看| 美日韩一区二区精品系列| 六月丁香六月综合缴情| 激情内射亚洲一区二区三区| 国产剧情欧美日韩中文在线| 午夜直播免费福利平台| 激情内射亚洲一区二区三区| 日韩欧美中文字幕av| 国产午夜精品美女露脸视频| 亚洲国产日韩欧美三级|