蛋白免疫印跡雜交（Western Blot WB）是將蛋白樣本通過聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離，再轉移到雜交膜（blot）上，然后通過一抗/二抗復合物對靶蛋白進行特異性檢測的方法。WB是進行蛋白質分析最流行和成熟的技術之一。本指南討論Western Blot操作方法及常見問題分析，有助于成功完成WB。
A 蛋白樣本提取制備
1 細胞或組織裂解
2 蛋白酶和磷酸酶抑制劑
3 蛋白定量
4 電泳上樣樣品的準備
B 電泳
1 PAGE膠的制備
2 蛋白分子量Marker
3 陽性對照
4 內參對照
5 上樣與電泳
C 轉膜與顯色（Western Blot）
1 膠中蛋白的檢測
2 蛋白轉膜
3 膜上蛋白的檢測：麗春紅
4 膜的封閉
5 一抗的孵育
6 二抗的孵育
7 顯色
D 常見問題分析與解決方案
附錄1 WB實驗試劑配制方法
附錄2 SDS-PAGE膠的配制
WB概述: 檢測原理:
A 蛋白樣本提取制備
蛋白樣品制備是Western Blotting的第一步，更是決定WB成敗的關鍵步驟，
總體原則和注意事項：
1：盡可能提取完全或降低樣本復雜度只集中于提取目的蛋白
（通過采用不同提取方法或選擇不同的試劑盒產品）
2：保持蛋白的處于溶解狀態(tài)（通過裂解液的PH 鹽濃度 表面活性劑、還原劑等的選擇）
3：提取過程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修飾等，（低溫操作，加入合適的蛋白酶和磷酸酶抑制劑）
4：盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子（通過加入核酸酶或采取不同提取策略）
5：樣品分裝，長期于-80℃中保存，避免反復凍融。
A-1 細胞或組織裂解
A-1-1 細胞裂解
裂解液Lysis buffer或商品化蛋白抽提試劑盒的選擇*
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目的蛋白分布定位 |
推薦裂解液Lysis buffe |
推薦試劑盒 |
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全細胞 |
NP-40 or RIPA（附錄1） |
全蛋白抽提試劑盒 |
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細胞質（可溶蛋白） |
Tris-HCl（附錄1） |
胞漿蛋白和核蛋白抽提試劑盒 線粒體蛋白提取試劑盒 |
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細胞質（細胞骨架等不溶蛋白） |
Tris-Triton（附錄1） |
蛋白分級抽提試劑盒 |
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細胞質（磷酸化蛋白） |
|
磷酸化蛋白抽提試劑盒 |
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細胞膜 |
NP-40 or RIPA（附錄1） |
膜蛋白抽提試劑盒 蛋白分級抽提試劑盒 |
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細胞核 |
RIPA（附錄1） |
核蛋白抽提試劑盒 |
|
線粒體 |
RIPA（附錄1） |
線粒體蛋白抽提試劑盒 亞細胞定位蛋白抽提試劑盒 |
細胞裂解操作方法：
1 培養(yǎng)的細胞經預冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑（種類與量見本節(jié)2）
2 吸凈PBS，加入預冷的裂解液，（(1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask; 0.5ml per 5x106
cells/60mm dish/75cm2 flask).
3 用細胞刮子刮取貼壁細胞，將細胞及裂解液溫和地轉移至預冷的微量離心管中，
4 4℃搖動30 min
5 4℃離心12,000 rpm，20 min（根椐細胞種類不同調整離心力）
6 輕輕吸取上清，轉移至新預冷的微量離心管中置于冰上，即為蛋白樣本，棄沉淀.
A-1-2 組織裂解
1 用滅菌的預冷的工具分離目的組織，盡量置于冰上以防蛋白酶水解，
2 將組織塊放在圓底的微量離心管或Eppendorf管中，加入液氮凍結組織于冰上均質研磨，長期可保存于-80°C，
3 每約5 mg加入約300 μl 預冷的裂解液lysis buffer，冰浴勻漿后置于4℃搖動2小時，裂解液體積與組織樣本量有適當比例，（最終的蛋白濃度至少達到0.1 mg/ml, 理想的蛋白濃度應為1-5 mg/ml).
4 4℃離心12,000 rpm，20 min，輕輕吸取上清，轉移至新預冷的微量離心管中置于冰上，即為蛋白樣本，棄沉淀,
A-2 蛋白酶和磷酸酶抑制劑
推薦購商品化蛋白酶和磷酸酶抑制劑復合試劑盒或COOKTAIL，或按下表配制：
備注：其中Sodium orthovanadate 配制活化方法如下：
所有步聚均需在通風櫥中進行：
1. 用雙蒸水配制100 mM 正礬酸鈉溶液.
2. 用鹽酸HCl 調至pH 9.0
3. 煮沸至溶液無色,盡量減少水分揮發(fā).
4. 冷卻至室溫
5. 再調pH 至 9.0
6. 再煮沸至無色
7. 重復上述過程,直至溶液煮沸冷卻后達pH 9.0
8. 用水定容至原體積
9. 分裝保存于- 20°C. 溶液變黃則棄之不用.
A-3 蛋白定量
Bradford 法 Lowry 法或BCA 法 （均有商品化試劑盒可選擇，操作簡單、需分光光度計或酶標儀），小牛血清白蛋白 (BSA) 作為標準曲線。如果裂解液中有NP40或其它表面活性劑，則推薦使用BCA 法。三種方法或產品比較列表如下：
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方法 |
原理 |
靈敏性 |
干擾因素 |
應用 |
|
Lowry法 Folin－酚試劑法 |
蛋白質在堿性溶液中肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質一銅復合物，還原酚磷鉬酸產生藍色化合物，藍色深淺與蛋白質濃度呈線性關系 |
較高約5μg/ml 對可達1-1500μg/ml
|
適用于脂類含量較高的樣品測定，也能耐受相當濃度的去垢劑如SDS。 受硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；各種硫醇干擾 |
耗費時間長40～60分鐘；操作要嚴格計時；顏色深淺隨不同蛋白質變化; 標準曲線不是嚴格的直線形式，且專一性差 |
|
Bradford法 |
考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合呈藍色，在波長595nm吸收峰，在一定的范圍內與蛋白質的含量呈線性關系 |
高約1～5μg/ml, 微孔法測定范圍為1-25μg/ml 試管法測定范圍為100-1500μg/ml |
易受強堿性緩沖液，TritonX-100，SDS等去污劑的影響 |
快速5～15分鐘，顏色穩(wěn)定；深淺隨不同蛋白質變化; 標準曲線有輕微的非線性 |
|
BCA法 |
BCA法基于雙縮脲原理，堿性條件下蛋白質將Cu2+還原 成 Cu1+ ，BCA（Bicinchoninic 酸）螯合Cu1+ 作為顯色劑，產生蘭紫色并在562 nm有吸收峰單價Cu1+與蛋白呈劑量相關性， |
很高0.5-20μg/ml 試管法可測范圍 20–2,000 μg/ml 微孔法為 0.5～10μg/ml |
不易受一般濃度去污劑的干擾 可受螯合劑；略高濃度的還原劑的影響 |
較快40分鐘內，較好的方法；抗干擾能力強 |
BCA測定方法如下:
A． 酶標板操作
1. 標準曲線的繪制：取一塊酶標板，按照下表加入試劑
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孔號 |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
|
蛋白標準溶液（μL） |
0 |
1 |
2 |
4 |
8 |
12 |
16 |
20 |
|
去離子水（μL） |
20 |
19 |
18 |
16 |
12 |
8 |
4 |
0 |
|
對應蛋白含量（μg） |
0 |
0.5 |
1.0 |
2.0 |
4.0 |
6.0 |
8.0 |
10.0 |
2. 根據樣品數量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50:1）配制適量BCA工作液，充分混勻；
3. 各孔加入200μL BCA工作液；
4. 把酶標板放在振蕩器上振蕩30sec，37℃放置30分鐘，然后在562nm下比色測定。以蛋白含量（μg）為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪出標準曲線；
5. 稀釋待測樣品至合適濃度，使樣品稀釋液總體積為20μL，加入BCA工作液200μL，充分混勻，37℃放置30分鐘后，以標準曲線0號管做參比，在562nm波長下比色，記錄吸光值；
6. 根據所測樣品的吸光值，在標準曲線上即可查得相應的蛋白含量（μg），除以樣品稀釋液總體積（20μL），乘以樣品稀釋倍數即為樣品實際濃度（單位：μg/μL）。
B． 分光光度計測定
1. 標準曲線的繪制：各管按照下表加入試劑
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孔號 |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
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蛋白標準溶液（μL） |
0 |
5 |
10 |
20 |
40 |
60 |
80 |
100 |
|
去離子水（μL） |
100 |
95 |
90 |
80 |
60 |
40 |
20 |
0 |
|
對應蛋白含量（μg） |
0 |
2.5 |
5.0 |
10.0 |
20.0 |
30.0 |
40.0 |
50.0 |
2. 根據樣品數量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50:1）配制適量BCA工作液，充分混勻；
3. 各管加入1000μL BCA工作液；
4. 各管充分混勻，37℃放置30分鐘，然后在562nm下比色測定。以蛋白含量（μg）為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪出標準曲線；
5. 稀釋待測樣品至合適濃度，樣品稀釋液總體積為100μL，加入BCA工作液1000μL，充分混勻，37℃放置30分鐘后，以標準曲線0號管做參比，在562nm波長下比色，記錄吸光值；
6. 根據所測樣品的吸光值，在標準曲線上即可查得相應的蛋白含量（μg），除以樣品稀釋液總體積（100μL），乘以樣品稀釋倍數即為樣品實際濃度（單位：μg/μL）。
A-4 電泳上樣樣品的準備
A-4-1 變性、還原蛋白樣本
一般的抗體只能識別抗原蛋白中的部份序列結構（表位），因此，為使抗體能夠達到結合該表位而需要將蛋白樣本進行變性，使之打開折疊的空間結構，
蛋白變性一般使用含陽離子變性去污劑如SDS的上樣buffer （loading buffer），并于95-100°C 煮沸 5分鐘，對于多次跨膜蛋白，可以于70°C 加熱 5-10分鐘，標準的上樣buffer稱為2X Laemmli buffer，上樣時與樣本?。?！混合后變性上樣即可：
2X Laemmli buffer
4% SDS
10% 2-mercaptoehtanol
20% glycerol
0.004% bromophenol blue
0.125 M Tris HCl
Check the pH and bring it to pH 6.8.
SDS的陰離子環(huán)繞蛋白肽鍵使之帶負電荷，蛋白分子量不同，結合的SDS數量不同，所帶負電荷也不同，電泳遷移速度不同，因此SDS-PAGE電泳可將不同分子量的蛋白分離開。
A-4-2天然和非還原樣本
某些抗體識別的表位是非連續(xù)氨基酸構成的蛋白三維結構，此種情況則需要進行非變性的WB，抗體的說明書一般會標注，這種非變性電泳不加SDS，樣本也不需煮沸。
某些抗體僅識別蛋白的非還原態(tài)，如某些cysteine基的氧化態(tài)，因此loading buffer和電泳液中不加入?-mercaptoethanol and DTT
|
蛋白狀態(tài) |
凝膠狀態(tài) |
loading buffer |
電泳緩沖液 |
|
還原—變性 |
還原和變性 |
有 ?-mercaptoethanol 或DTT 和SDS |
有SDS |
|
還原—天然 |
還原和非變性 |
有?-mercaptoethanol 或DTT ，無SDS |
無SDS |
|
氧化-變性 |
非還原和變性 |
無?-mercaptoethanol 或DTT ，有SDS |
有SDS |
|
氧化-還原 |
非還原和天然 |
無?-mercaptoethanol 或DTT ，無SDS |
無SDS |
注：除說明書特別標注之外，一般情況下，均使用變性和還原電泳
B 電泳
B-1 PAGE膠的制備
聚丙酰胺凝膠PAGE電泳根椐蛋白分子量進行分離蛋白，PAGE膠是由兩種化合物聚合而成的，即丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis).，聚合需加入過硫酸銨及DMAP 或 TEMED，凝膠為中性、水溶性、三維網狀結構。凝膠的孔徑取決于總丙烯酰胺的百分含量（%T)）和交聯(lián)度（%C），T%=(a+b)/m*100%; 和 C%=a/(a+b)*100%,其中: a=雙體(bis)的重量 ;b=單體(arc)的重量 ;m=溶液的體積(ml) 。丙烯酰胺總量增加，則孔徑減小，5%C構成最小的孔徑，任何的 %C增加或降低，孔徑都增加，凝膠的百分濃度組成需兩個參數，丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis).的總量百分濃度（w/v）。
不同分子量的蛋白選擇不同的凝膠濃度（參考下表》，原則上高分子量蛋白用低濃度膠，低分子量蛋白用高濃度膠分離。
|
蛋白分子量 (kDa) |
凝膠濃度 (%) |
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4-40 |
20 |
|
12-45 |
15 |
|
10-70 |
12.5 |
|
15-100 |
10 |
|
25-200 |
8 |
不同濃度的凝膠的配制方法見附錄2 首先配制各組分貯備液，然后分別配制濃縮膠和分離膠。
B-2 蛋白分子量Marker
預染或非預染各種分子量的蛋白，用于標示電泳中蛋白的大小和示蹤
商業(yè)化產品：
非預染Marker (MW 116, 97.4, 66, 45, 36 29, 24, 20.1, 14.2KDa)
預染Marke r (MW 116, 97.4, 66, 45, 36 29, 24, 20.1, 14.2KDa)
B- 3 陽性對照
目的蛋白或明確表達目的蛋白的組織或細胞的蛋白提取物，用于檢驗整個實驗體系和過程的正確性有效性/特別是一抗的質量和效率。建議使用該對照。可查閱文獻或抗體說明書選擇購買或自提該對照樣本。
B-4 內參對照
管家基因編碼的、很多組織和細胞中都穩(wěn)定表達的蛋白，用于檢測整個WB實驗過程及體系是否正常工作，并作為半定量檢測目的蛋白表達量的標準對照。必須設立。
內參Beta-actin 抗體 at 1/5000 dilution, Lysates/proteins at 20 ug per lane Lane 1 : HeLa nuclear Lane 2 : HeLa whole cell lysate Lane 3 : A431 cell lysate Lane 4 : Jurkat cell lysate Lane 5 : HEK293 cell lysate.
B-5 上樣與電泳
每孔上樣量為20-40 μg蛋白，使用專用槍頭或注射針頭，勿溢出加樣孔，
標準電泳緩沖液：1X Tris-glycine：
25 mM Tris base
190 mM glycine
0.1% SDS
調 pH;8.3.
電泳時間按電流儀說明書推薦方法使用,(1小時或過夜，取決于電壓大?。?，當染料到達膠的底部，關電源停止電泳，膠不能存放，應立刻進行下一步的轉膜。
C 轉膜與顯色（Western Blot）
C-1 膠中蛋白的檢測
電泳后檢測蛋白是否遷移正確與平均，可采用銅染或考馬斯藍染色檢測，如果凝膠中的蛋白需要進行轉膜則需可逆的銅染法，否則采用不可逆考馬斯藍法染色。
銅染法：電泳膠用蒸餾水洗數秒鐘，加入0.3 M CuCl2染色5-10分鐘，再用去離子水洗一次，在暗背景下觀察在蘭色膠背景下蛋白出現透明條帶，膠置于0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0緩沖液中漂洗脫色兩次，再置于電轉緩沖液中開始轉膜。
考馬斯藍法：用40%雙蒸水, 10% 醋酸, 50%甲醇的溶液固定膠中蛋白，考馬斯藍R-250染液（凱基產品）室溫染色4小時至過夜，保持搖勻，轉入67.5%雙蒸水, 7.5% 醋酸, 25%甲醇l搖勻至脫去多余的染料，蛋白被染成深藍色。
C-2 蛋白轉膜
蛋白因結合SDS而帶電荷，在電場下從膠中轉至膜上，轉膜操作根椐電轉儀制造商的說明書進行轉膜方式分為半干和濕轉兩種，半干式轉膜速度快，而濕式成功率高并特別適合用于分子量大于100KD的蛋白。
濕式轉膜三明治排列為：海綿/紙/膠/膜/紙/海綿，全部緊密排列，特別是膠/膜之間不能留有氣泡，三明治安放的方向確認正確負極方為帶負電的膠里的蛋白，向正極方（膜）電遷移。
標準的電轉緩沖液為1X Tris-glycine buffer 不含SDS，但加入20%甲醇，如果轉膜的蛋白分子量大于80KD，則推薦加入SDS使之終濃度為0。1%。
半干式轉膜中，三明治的排列為：/紙/膠/膜/紙，用電轉緩沖液浸濕后，直接置于電轉儀的正負極之間。膠于負極而膜置于正極。半干式的電轉緩沖液可不同于濕式的電轉緩沖液，推薦為：48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇，
兩類膜可供選擇：硝酸纖維素膜和PVDF膜（正電荷尼龍膜），根據不同需要選擇（下表），PVDF膜需要浸泡甲醇中1-2分鐘，再孵育于冰冷的電轉緩沖液中5分鐘，膠也需在冰冷的電轉緩沖液中平衡3-5分鐘，否則轉膜時會導致條帶變形。
注：大蛋白和小蛋白的轉膜
電轉移緩沖液中SDS與甲醇的平衡、蛋白的大小、膠的濃度都會影響轉膜效果，如下調整可以增加轉膜效率：
大蛋白（大于100 KD）
1．對于大蛋白而言，其在凝膠電泳分離遷移較慢，而從凝膠轉出也非常慢，因此對于這種大分子量蛋白應該用低濃度的凝膠，8%或更低，但因低濃度的膠非常易碎，所以操作時需十分小心，
2 大蛋白易在凝膠里形成聚集沉淀，因此；轉膜時在電轉移緩沖液加入終濃度為0.1%的SDS，以避免出現這種情況，甲醇易便SDS從蛋白上脫失，因此應降低電轉移緩沖液中甲醇的濃度至10%或更低，以防止蛋白沉淀。
3 降低電轉移緩沖液中甲醇的比例以促進凝膠的膨脹，易于大蛋白的轉出。
4 如果使用硝酸纖維素膜，甲醇是必需的，但如果是PVDF膜，甲醇可以不必加入電轉移緩沖液中，但轉膜前PVDF需用甲醇活化。
5 選擇濕式，4℃轉膜過夜，以取代半干式轉膜。
小蛋白（小于100 KD
1 SDS妨礙蛋白與膜的結合，特別是對小蛋白更是如此，因此，對于小分子的蛋白，電轉移緩沖液中可以不加SDS。
2 保持20%的甲醇濃度
對于大于500KD的蛋白，請參考下述文獻：Bolt and Mahoney, High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide, gel electrophoresis. Analytical Biochemistry 247, 185–192 (1997).
更多的轉膜注意事項：
? 避免用直接接觸膜，應使用鑷子，手指上的油脂與蛋白會封閉轉膜效率并易產生背景污斑
? 排列三明治時，盡量用移液器或15ml試管趕除膠與膜之間的氣泡，或將三明治放在裝有的培養(yǎng)皿中以防止氣泡產生，請戴手套！
? 確認裁剪的膜和濾紙與凝膠尺寸相同，否剛導致電流不能通過膜，從而轉膜無效
? 雞抗體易于與PVDF膜和其它尼龍膜結合，導致高背景，請?zhí)鎿Q成硝酸纖維素膜以降低背景。
C-3 膜上蛋白的檢測：麗春紅
為檢測轉膜是否成功，可用麗春紅染色，
2%的麗春紅貯備液(20ML)：: 2%麗春紅(0.4克)溶于30%三氯乙酸(6克)和30%磺基水楊酸(6克)
麗春紅染色工作液：2%的麗春紅貯備液1：10稀釋，即加9 倍的ddH2O
染色方法：
將膜放入TBST洗一次，再置于麗春紅染色工作液中,在室溫下?lián)u動染色5分鐘，大量的水洗膜直至水變清無色蛋白條帶清晰，（膜也可以用TBST或水重新洗后再進行染色）PVDF膜需用甲醇再活化后用TBST洗后進行封閉。
10x TBS的配制
24.23 g Trizma HCl
80.06 g NaCl
加約 800 ml 超純水
用純HCl調pH 至7.6
定容至 1 L.
TBST的配制
配制 1 L TBST：: 量取100 ml 10x TBS + 900超純水 + 1ml Tween20
Tween20非常粘稠，用槍頭不易吸取，請確定加入準確的量，最好用Tris buffer.配成10%的Tween20母液后使用。
C-4 膜的封閉
為防止一抗或/和二抗與膜的非特異性結合產生的高背景，因此需要進行膜的封閉，
傳統(tǒng)上有兩種封閉液：脫脂奶粉或BSA，脫脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（因脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白），使用脫脂奶粉會結合磷酸化抗體從而易產生高背景。
某些抗體用BSA封閉時因不明原因可能會產生比脫脂奶粉更強的信號，，請仔細閱讀說明書注明的注意事項和膜的特殊的封閉方法。
配制5%脫脂奶粉或 BSA 溶液：每100 ml TBST中加入5 g脫脂奶粉或 BSA，混勻后過濾，如不過濾會導致使膜污染上細微黑顆粒。
封閉時，4°C搖動，封閉1 hour ，再用TBST洗5秒，進入下一步抗體的孵育。
C-5 一抗的孵育
孵育Buffer：按抗體說明書建議的稀釋倍數，用TBST稀釋一抗，如果說明書沒有建議的稀釋倍數，則參照一般推薦的稀釋倍數(1:100-1:3000)，一抗?jié)舛冗^高會導致產生非特異性條帶。
某些實驗室傳統(tǒng)上在封閉液中孵育抗體，而有些實驗室用不含封閉劑的TBST來孵育抗體，結果因抗體而異，有時兩者結果相同，有時結果不同。
注：如果不存在高背景的問題，某些抗體用含低濃度(0.5 – 0.25%) 脫脂奶粉或 BSA的封閉液來,稀釋，可產生相對更強的信號條帶。
孵育時間：一抗的孵育時間可從幾小時至過夜（一般不超過18小時）不等，取決于抗體與蛋白的親和性和蛋白的含量豐度，建議使用較高的抗體稀釋倍數和較長的孵育時間來保證特異性結合。
孵育溫度：盡可能低溫孵育，如果在封閉液中孵育一抗過夜，應在4oC進行否則會產生污染而破壞蛋白（降別是磷酸基團）。
孵育一抗時需保持適當的搖動使之均勻覆沒膜，防止結合不均勻。
C-6 二抗的孵育
一抗孵育結束后，用TBST搖動洗膜數次，每次5min或更長，去除殘留的一抗。
孵育Buffer和稀釋倍數：用TBST按說明書推薦的倍數稀釋二抗，如果說明書沒有標出稀釋倍數，則按常規(guī)的倍數稀釋(1:1000- 1:20,000)預試，二抗的濃度過高也會導致非特異性條帶。亦可以在封閉液中孵育二抗（和一抗），但可能在降低背景同時導致特異性條帶的信號也減弱，可能是封閉劑阻礙了抗體與靶蛋白的結合。
孵育時間和溫度：室溫、1-2 hours, 搖動
二抗連接物：推薦使用二抗連接HRP，不建議連接AP堿性磷酸酶，因其不夠靈敏。
C-7顯色
顯色分為酶促底物發(fā)光和化學發(fā)光法或熒光法
酶促底物發(fā)光法代表為DAB顯色法，與其它同類方法的比較如下圖所示：
而現在最常用的是化學發(fā)光法：HRP化學發(fā)光底物 Luminol（ECL法 chemiluminescence）及其改良法，
對于 HRP偶聯(lián)的二抗，一般傳統(tǒng)上使用ECL 和ECL+，推薦使用后者，更靈敏。其中不同商家的產品特點總結如下表：
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SuperSignal? West Pico化學發(fā)光底物 |
SuperSignal? West Femto超靈敏型底物 |
SuperSignal? West Femto增強型底物 |
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主要優(yōu)點 |
與ECL? 系統(tǒng)相比減半的價格、雙倍的信號 |
適用于HRP檢測的最靈敏的化學發(fā)光底物 |
延長的信號持續(xù)時間使這種底物用于今天的成像設備最為理想 |
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檢測下限 |
10-12g |
10-15g |
10-14g |
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信號持續(xù)時間 |
6-8小時 |
8小時 |
24小時 |
|
首選檢測方法 |
X膠片 |
成像設備或X膠片 |
成像設備或X膠片 |
|
建議一抗稀釋度 |
1:1000-1:5000 |
1:5,000-1:100,000 |
1:1000-1:50,000 |
|
建議二抗稀釋度 |
1:20,000-1:100,000 |
1:100,000-1:500,000 |
1:50,000-1:250,000 |
|
產品保存期 |
室溫1年 |
4℃1年或室溫6個月 |
室溫1年 |
|
建議印跡膜 |
硝化纖維 |
硝化纖維或PVDF |
硝化纖維或PVDF |
X-ray 膠片：傳統(tǒng)上使用手工曝光的方法，可控制X-ray 膠片在曝光和在定影劑的時間調節(jié)。而全自動X-ray 膠片曝光器也廣泛使用并操作簡便。
注意不能過度曝光，特別不適于檢測相對蛋白量，過度曝光導致全暗的背景沒有反差和/或產生大量的非特異性條帶。
數字圖像顯影：新一代的膠片顯色方法是使用數碼相機在暗室中拍攝膜上的化學發(fā)光，將其轉成數字信號，再通過儀器自帶的軟件進行分析。 有些新一代商品化的數字成像儀器已不再檢測HRP連接的抗體（如：ECL chemiluminescence），如STORM分析儀只檢測熒光標記的抗體。
D 常見問題分析與解決方案
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問題 |
可能原因 |
驗證或解決辦法 |
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背景高 |
封閉不充分 |
延長封閉時間， 更換合適的封閉劑（脫脂奶粉，BSA，血清等） |
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一抗?jié)舛冗^高 |
增加一抗稀釋倍數, |
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抗體孵育溫度過高 |
4℃孵育 |
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二抗非特異性結合 或與封閉劑交叉反應 |
設置二抗對照(不加一抗),降低二抗?jié)舛?/p> |
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一抗或二抗與封閉劑 有交叉反應 |
在孵育和洗滌液中加入Tween-20 以減少交叉反應. |
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洗膜不充分 |
增加洗滌次數 |
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膜不合適 |
NC膜比PVDF膜背景低 |
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膜干燥 |
保證充分的反應液，避免出現干膜現象 |
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沒有陽性條帶 或很弱 |
一抗、二抗等不匹配 |
訂購試劑時認真選取一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底物。可通過設置內參可以驗證二級檢測系統(tǒng)的有效性。 |
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一抗或/和二抗?jié)舛鹊?/p> |
增加抗體濃度，延長孵育時間 |
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封閉劑與一抗或二抗有交叉反應 |
封閉時使用溫和的去污劑，如TWEEN20，或更換封閉劑（常用的脫脂奶、BSA、血清或明膠 |
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一抗不識別目的物種的靶蛋白 |
檢查說明書，或做ClustalW比對，設陽性對照 |
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樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過低（抗原無效） |
設置陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加標本上樣量至少每孔20-30ug蛋白,樣本制備時使用蛋白酶抑制劑,或分級提取目的蛋白。 |
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轉膜不充分,或洗膜過度 |
使用麗春紅S檢測轉膜效果,PVDF膜需浸透,需正確的轉膜操作,勿過度洗膜 |
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過度封閉 |
使用含0.5%脫脂奶或無脫脂奶的抗體稀釋液,或更換封閉劑,減少封閉時間 |
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一抗失效 |
使用有效期內抗體,分裝保存,避免反復凍融取用, 工作液現配現用 |
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二抗受疊氮鈉抑制 |
所用溶液和容器中避免含有疊氮鈉(HRP的抑制劑) |
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酶和底物失效 |
直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯(lián)物,使用新鮮的底物. |
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曝光時間過短 |
延長曝光時間 |
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多非特異性條帶 或條帶位置不對 |
細胞傳代次數過多，使其蛋白表達模式的分化 |
使用原始或傳代少的細胞株，或平行實驗 |
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體內表達的蛋白樣本具有多種修飾形式：乙酰化、磷酸化、甲基化、烷基化、糖基化等 |
查文獻，使用去修飾的試劑使蛋白恢復其正確的大小 |
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蛋白樣本降解 |
使用新鮮制備的標本，并使用蛋白酶抑制劑 |
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新蛋白或同族蛋白的分享同種表位的不同剪接方式 |
查其它文獻報導，或BLAST搜尋，使用說明書報導的細胞株或組織 |
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一抗?jié)舛冗^高 |
降低抗體濃度，可以減少非特異性條帶 |
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二抗?jié)舛冗^高 產生非特異性結合 |
降低抗體濃度，增加二抗對照 選擇特異性更強，只針對重鏈的二抗 |
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抗體未純化 |
使用單克隆或親和純化的抗體，減少非特異條帶 |
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蛋白存在二聚體或多聚體 |
SDS-PAGE電泳上樣前，煮沸10 min， 以增強蛋白質解聚變性 |
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背景有白色/黑色斑點 |
轉膜時有氣泡或抗體分布不均 |
盡量去除氣泡，抗體孵育時保持搖動 |
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抗體與封閉劑結合 |
過濾封閉劑 |
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暗片現白條帶 |
一抗或二抗加入過多 |
稀釋抗體的濃度 |
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目的條帶過低/過高 |
SDS-PAGE膠濃度選擇不合適 |
調整膠濃度，分子量大的蛋白用低濃度膠，分子量小的蛋白用高濃度膠 |
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“微笑”條帶 |
遷移過快 電泳溫度過高 |
降低電泳速度，低溫電泳（冷室） |
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轉膜不充分 |
膜沒有完全均勻濕透 |
使用100% methanol浸透膜 |
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靶蛋白分子量小于10,000 |
選擇小孔徑的膜，縮短轉移時間 |
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靶蛋白等電點等于或接近轉移緩沖液pH值 |
可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液（pH 10.5)或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液 |
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甲醇濃度過高 |
過高甲醇濃度會導致蛋白質與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時會使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替 |
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轉移時間不夠Thick gel |
對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉移時間 |
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ptimization of secondary antibody dilution for immunodetection of ERK 1 with Immobilon Western Chemilumin-escent HRP Substrate. Two-fold dilutions of rat liver lysate samples were applied to each gel. Electroblotted proteins were probed with rabbit anti-ERK 1 antibody (1:1,000 dilution) and HRPconjugated goat anti-rabbit IgG (1:5,000, 1:20,000 and 1:100,000dilutions, left to right). |
附錄1 WB實驗試劑配方
1 Nonidet-P40 (NP40) buffer
150 mM sodium chloride
1.0% NP-40 (或Triton X-100 )
50 mM Tris, pH 8.0
2 RIPA buffer (Radio Immuno Precipitation Assay buffer)
150 mM sodium chloride
1.0% NP-40 or Triton X-100
0.5% sodium deoxycholate
0.1% SDS (sodium dodecyl sulphate)
50 mM Tris, pH 8.0
注：The 10% sodium deoxycholate stock solution (5 g into 50 ml) must be protected from light.
3 Tris-HCl buffer
20 mM Tris-HCl, pH 7.5
4 Tris-Triton buffer
10 mM Tris, pH 7.4
100 mM NaCl
1 mM EDTA
1 mM EGTA
1% Triton X-100
10% glycerol
0.1% SDS
0.5% deoxycholate
All four of these buffers will keep at 4oC for several weeks or for up to a year aliquotted and stored at -20oC.
5 TBS 10x (concentrated TBS)
24.23 g Trizma HCl
80.06 g NaCl
Mix in 800 ml ultra pure water.
pH to 7.6 with pure HCl.
Top up to 1 L.
TBST
For 1 L: 100 ml of TBS 10x + 900 ml ultra pure water + 1ml Tween20
6 PBS: 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4
附錄2 SDS-PAGE膠的配制
一 30% (W/V) Acrylamide 的配制
1稱量Acrylamide290g，Bis10 g下列試劑，置于1 L燒杯中
2向燒杯中加入約600 ml的去離子水，充分攪拌溶解。
3. 加去離子水將溶液定容至1 L，用0.45 mm濾膜濾去雜質。
4. 于棕色瓶中4℃保存。
注意：丙烯酰胺具有很強的神經毒性，并可通過皮膚吸收，其作用具有積累性，配制時應戴
手套等。聚丙烯酰胺無毒，但也應謹慎操作，因為有可能含有少量的未聚合成份。
二 配制濃縮膠緩沖液： 1.0mol/L TrisHCl Ph6.8, 4℃保存
三 配制分離膠緩沖液： 1.5mol/L TrisHCl Ph8.8, 4℃保存
四 配制10%SDS（W/V）：
五 配制10% W/V）過硫酸銨（AP）：稱1克過硫酸銨，加10mL去離子水攪拌溶解，貯存于4℃。（注意10%過 硫酸銨溶液在4℃保存可使用2周左右，超過期限會失去催化作用。
六 TEMED原溶液
七 電泳緩沖液（5×）：Tris 15g+甘氨酸72g+SDS 5g+H2O至1L,臨用時稀釋5倍至1×SDS電泳緩沖液加入電泳槽中。
八 配制1 M Tris-HCl的方法
1. 稱量121.1 g Tris置于1 L燒杯中。
2. 加入約800 ml的去離子水，充分攪拌溶解。
3. 加入濃鹽酸調節(jié)所需要的pH值。
4 將溶液定容至1 L。
5. 高溫高壓滅菌后，室溫保存。
注意：應使溶液冷卻至室溫后再調定pH值，因為Tris溶液的pH值隨溫度的變化差異很大，溫度每升高1℃，溶液的pH值大約降低0.03個單位。
九: PAGE濃縮膠（5% Acrylamide）配方表
十 SDS-PAGE分離膠配方表
