WB（Western Blot）即蛋白印跡法，其原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。

蛋白免疫印跡一般由樣本處理、凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學(xué)檢測組成。

WB中檢測樣本來源主要是細(xì)胞、組織、微生物、植物等蛋白樣本；在WB檢測中，樣本中蛋白提取的是否充分，在整個WB檢測中非常的重要。樣品提取的方法常見的為機(jī)械法、物理法和化學(xué)及生物化學(xué)方法。

A：機(jī)械法

* 高速組織搗碎機(jī)（轉(zhuǎn)速可達(dá)10000rpm，具高速轉(zhuǎn)動的鋒利的刀片），宜用于動物內(nèi)臟組織的破碎；

* 玻璃勻漿器（用兩個磨砂面相互摩擦，將細(xì)胞磨碎），適用于少量材料，對細(xì)胞破碎程度較高速搗碎機(jī)高，機(jī)械切力對分子破壞較??；

B：物理法

反復(fù)凍融法、冷熱變替法、超聲波法、加壓破碎法；

C：化學(xué)及生物化學(xué)方法

* 有機(jī)溶媒法、自溶法、酶法、表面活性劑處理；

* 樣本經(jīng)過處理后，使樣本中的蛋白能夠解離出來，用于后續(xù)的檢測；

* 現(xiàn)在用的較多的是提取方法是以上幾種方法聯(lián)用，最常規(guī)的就是RIPA裂解液。其中根據(jù)蛋白性質(zhì)的不同，我們選擇的裂解液也不一樣。

裂解液的比較：

1、用于普通的Western、IP或co-IP，我們推薦使用Western及IP細(xì)胞裂解液，裂解細(xì)胞或組織后，沒有非常粘滯的透明狀DNA團(tuán)塊形成，不必采用超聲處理等就可以非常理想地用于后續(xù)操作。另外該裂解液裂解的產(chǎn)物也適合用于磷酸化蛋白的Western檢測。

2、對于某些特殊蛋白的IP，如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細(xì)胞裂解液效果不是非常理想，可以嘗試用RIPA裂解液(強(qiáng)、中或弱)或NP-40裂解液。如果發(fā)現(xiàn)IP的時候背景很高，即非特異的蛋白也被IP下來，則需要選用裂解強(qiáng)度較高的裂解液，例如RIPA裂解液(強(qiáng)或中)。如果發(fā)現(xiàn)目的蛋白無法被IP下來，則說明裂解液的強(qiáng)度過強(qiáng)，可以使用較為溫和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。

3、對于某些難溶解蛋白的Western，如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細(xì)胞裂解液效果不是非常理想，可以嘗試使用裂解強(qiáng)度更高的裂解液例如RIPA裂解液(強(qiáng)、中)或SDS裂解液。

tips：曾有同學(xué)抱怨購買我們組蛋白修飾的抗體試劑盒，但檢測的信號太弱了。后來得知該同學(xué)是RIPA buffer裂解細(xì)胞后離心收集上清再加入loading buffer制備樣品，殊不知像組蛋白這類水溶性很差且與DNA結(jié)合緊密的蛋白，需要超聲處理裂解細(xì)胞，如果只是收集上清往往可能造成很大的損失哦！

樣品制備完，應(yīng)立即低溫保存（-20℃短期（幾天））；-80℃長期；例外，IP用樣品應(yīng)直接進(jìn)行IP，避免凍融破壞蛋白質(zhì)間的相互作用。在樣品制備過程中，另一個需要注意的問題是，從樣品制備的起始階段就要注意定量問題；WB本身系統(tǒng)誤差有20%，太細(xì)微的差別經(jīng)常忽略不計(jì)。細(xì)胞樣品可以先計(jì)數(shù)再接種，短時間內(nèi)即使細(xì)胞生長有差異也不會對WB結(jié)果影響太多。組織樣品，從腫瘤組織的大?。ǚQ重）開始，裂解液的體積都是精確定量的，操作過程也盡量避免蛋白損失。

基本原理：凝膠由兩種不同的凝膠層組成。上層為濃縮膠，下層為分離膠。濃縮膠為大孔膠，緩沖液pH6.8，分離膠為小孔膠，緩沖液pH8.8。

tips：制膠過程中，切記膠一定要平，凝膠的速度不能過快，當(dāng)然購買預(yù)制膠的土豪可以直接忽略。。

電泳時，點(diǎn)樣順序需要提前做好設(shè)計(jì)，空的泳道需要點(diǎn)上等體積的1X loading buffer。通常是恒壓電泳，具體電壓根據(jù)各自儀器的不同而略有差異，但不要太高。樣品間濃度差異過大、鹽濃度過高、太過粘稠、有不溶的顆粒物、膠孔不齊等是條帶不夠美觀的主要因素，大家盡量避免。

在一定濃度的凝膠中，由于分子篩效應(yīng)，則電泳遷移率就成為蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)，蛋白分子量在15kD～200 KD的范圍內(nèi)，電泳遷移與分子量的對數(shù)呈直線關(guān)系。

根據(jù)蛋白分子量大小的不同，選擇不同濃度的分離膠用于實(shí)驗(yàn)。

tips：8%膠最底邊約36KDa，10%最底邊約25KDa，12%最底部約12KDa。8%膠可以跑300KDa-36KDa之間的任意蛋白，轉(zhuǎn)膜效率對WB結(jié)果的的影響都問題不大。12%，180KDa左右，轉(zhuǎn)膜效率對WB結(jié)果的影響都問題不大。對于大蛋白轉(zhuǎn)印，很多書本建議采用低濃度膠，如6%SDS-PAGE。但實(shí)際操作發(fā)現(xiàn)，6%太軟，制作轉(zhuǎn)印三明治的操作非常麻煩；且內(nèi)參如Actin、tubulin都在45KDa附近，而6%膠底邊溴酚藍(lán)指示55KDa左右，除非采用一些論壇上有人提過的灌注不同濃度的膠或梯度膠，否則需要同時跑兩塊膠，因此也不是很推薦。小編經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為300KDa以下8%膠（底邊36KDa）都可以勝任，可以適當(dāng)調(diào)整選擇7-8%膠同時可以兼顧內(nèi)參和大蛋白。

基本原理：SDS-PAGE凝膠中的蛋白帶有SDS負(fù)電，在電場的作用下，帶負(fù)電的蛋白會轉(zhuǎn)移到膜上。即，把凝膠中已分成條帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纖維素膜（NC 膜）和聚偏二氟乙烯（PVDF 膜），蛋白轉(zhuǎn)移的方法多用電泳轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)移電泳）。

方法選擇：半干轉(zhuǎn)法or濕轉(zhuǎn)法？

轉(zhuǎn)膜方法一般有半干轉(zhuǎn)法和濕轉(zhuǎn)法。兩者原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機(jī)械裝置不同。濕轉(zhuǎn)適合所有的蛋白，轉(zhuǎn)膜效率最佳，但靡費(fèi)試劑、溶液，對普通分子量大小的蛋白轉(zhuǎn)染操作時間長于半干轉(zhuǎn)（下文會具體給出條件）；半干轉(zhuǎn)適合分子量較小的蛋白，省時、省試劑。蛋白分子大小如何界定呢？習(xí)慣上認(rèn)為100KDa以上為大蛋白，其他均屬于小蛋白，當(dāng)然這只是一個相對標(biāo)準(zhǔn)。因此，通常對大蛋白的轉(zhuǎn)印多數(shù)人會選擇長時程的濕轉(zhuǎn)。

有必要指出的是，實(shí)際上用半干轉(zhuǎn)緩沖液進(jìn)行濕轉(zhuǎn)效果也非常理想，通常這種緩沖液可以反復(fù)使用多次（<=5次常規(guī)1hr電轉(zhuǎn)，如有3hrs長時程轉(zhuǎn)染，緩沖液使用次數(shù)會減少），不過要注意初始電流（同樣溫度下，初始電流高，表明緩沖液中電解質(zhì)剩余不多，為確保轉(zhuǎn)膜溫度，可開始或中途更換新鮮轉(zhuǎn)膜液）。電轉(zhuǎn)液中SDS增加蛋白的水溶性，促進(jìn)蛋白在電轉(zhuǎn)液中泳動。若不加SDS，蛋白會沉淀在膠上，但SDS過多會影響蛋白與膜的吸附。甲醇能使SDS與蛋白分離，甲醇濃度越高SDS與蛋白分離越快，但高濃度的甲醇對蛋白會有固定作用，不利于蛋白從膠里跑出來。一般來說甲醇的濃度為20%，但PVDF膜截留marker上交聯(lián)的小分子顏料的能力很差，可考慮提升甲醇的濃度至25%（它對普通蛋白的轉(zhuǎn)膜影響不太，顏料截留更多）；大蛋白轉(zhuǎn)印可考慮降低甲醇濃度。甲醇的另一個作用是降溫，舊的電轉(zhuǎn)液由于電解質(zhì)的消耗和甲醇的揮發(fā)，電轉(zhuǎn)時電流或電壓變化更快、溫度升高也更快，因此可考慮增加額外的甲醇；這點(diǎn)對半干轉(zhuǎn)緩沖液的意義較大，因?yàn)榘敫赊D(zhuǎn)緩沖液消耗很慢，緩沖液放置的時間較久，甲醇揮發(fā)比較嚴(yán)重，可臨時少量補(bǔ)加。

tips：轉(zhuǎn)膜緩沖液的配制方法：39mMglycine2.9g, 48mMtris5.8g, SDS0.37g加入600ml去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻＜尤ルx子水將溶液定容至800ml后，加入200ml甲醇，室溫保存。有時，未將低昂地實(shí)驗(yàn)毒性，也可以將甲醇替換成乙醇，對實(shí)驗(yàn)的影響不大。

轉(zhuǎn)膜溫度：

轉(zhuǎn)膜最好在低溫進(jìn)行（高溫會局部溶膠或降低轉(zhuǎn)膜效率），盡管很多半干轉(zhuǎn)儀沒有具體要求，但用預(yù)冷過的電轉(zhuǎn)液濕濾紙比未預(yù)冷的轉(zhuǎn)印效率更高。因此，有條件建議濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)均在低溫（4℃）進(jìn)行。此外，濕轉(zhuǎn)緩沖液可以考慮轉(zhuǎn)印前-20℃預(yù)冷，時間不能長于2hrs，否則電泳液凍結(jié)。

轉(zhuǎn)膜三明治的制作：

制作轉(zhuǎn)膜三明治的過程中，書中強(qiáng)調(diào)過濾紙、膠、膜的大小最好一致，否則沒有膠、膜隔開部分的濾紙會因?yàn)橹苯咏佑|而產(chǎn)生局部短路，降低內(nèi)阻增加電（壓）流，造成升溫過快。但進(jìn)口儀器隨廠原包裝附帶的濾紙有限，如果每次都切割新濾紙，消耗過快、初次使用的膜轉(zhuǎn)膜效率不高，且增加額外的操作。因此，實(shí)際上濾紙大一些也不太要緊，但是小編會選擇已經(jīng)切割好的和膠面積最接近的濾紙；通常膜的大小會嚴(yán)格控制在與膠面積一致或略小一點(diǎn)點(diǎn)。操作時在保證每一層均無氣泡的前提下，疊好后再碾壓幾個來回，力道要均勻、恰好；力量過大，膠會被拉伸，條帶會扭曲、變形。碾壓的目的不是為了驅(qū)趕氣泡（完全可以做到疊加的時候每一層都無任何氣泡；諸如采用多層薄濾紙時可以一張張的疊加），更重要的作用是讓膜和膠貼得更緊密?？梢岳斫獾氖?，對于蛋白分子的大小而言，膠和膜之間的間距是數(shù)十萬倍計(jì)的，因此更緊密的接觸無疑是轉(zhuǎn)膜成敗的關(guān)鍵。

tips：在ABclonal的實(shí)驗(yàn)體系下，恒流（不低于200mA）轉(zhuǎn)40-200min（分子量大的目的蛋白需要更更高的電流和更長的時間）能滿足各種大小蛋白的實(shí)驗(yàn)需要。半干轉(zhuǎn)雖然速度快，但效果是不如濕轉(zhuǎn)的。觀察預(yù)染marker、轉(zhuǎn)膜后考染檢測凝膠可以幫你判斷轉(zhuǎn)膜效果。如果擔(dān)心轉(zhuǎn)過，0.2μm孔徑的膜是你最好的歸宿。轉(zhuǎn)膜會大量放熱，注意保持低溫；轉(zhuǎn)膜槽連續(xù)使用會有大量鹽在電極絲上析出，建議使用后用純水浸泡已維持正常的使用效果；細(xì)心、無氣泡是轉(zhuǎn)膜的基本素質(zhì)，只能幫你到這啦。

                 半干轉(zhuǎn)法裝置                                                       濕轉(zhuǎn)裝置

在轉(zhuǎn)膜過程中，膜的選擇非常重要。現(xiàn)在常用的膜有硝酸纖維素膜（NC）和PVDF膜。

硝酸纖維素（nitrocellulose, NC）膜：

NC膜與蛋白質(zhì)靠疏水作用結(jié)合，無需預(yù)先活化，對蛋白質(zhì)的活性影響??；非特異性本底顯色淺；價格低廉，使用方便。但小分子蛋白與NC膜結(jié)合力較差，洗滌時易丟失，同時NC膜韌性較差，易損壞； 

聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜：

與蛋白質(zhì)親和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正電基團(tuán)，使其更容易與帶負(fù)電荷蛋白結(jié)合。

tips：實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)

1．聚丙烯酰胺的30%母液會降解，要4℃避光保存。

2．APS會失效，10%APS一般保質(zhì)期才一個月左右。-20℃分裝長期保存。

3．注意Tris buffer的PH值，以及平時所用的水的PH值。PH值改變會使帶型非常怪異，所有蛋白和溴酚   藍(lán)壓成一條細(xì)線（即便在分離膠中），如果溴酚藍(lán)前有紅色染料，那么此染料彗星式拖尾從溴酚藍(lán)一直延伸到膠底部（溴酚藍(lán)此時涌動極緩慢，位于膠中上部）。

4．上下層式電泳裝置若漏液，哪邊漏液，電泳條帶往哪邊傾斜。內(nèi)外式電泳裝置漏液，則裝置處于短路狀態(tài)，液體會過熱。SDS-PAGE膠可能局部自溶，條帶扭曲、變形。

5．配膠用玻璃板和邊條應(yīng)及時洗凈。

玻板未洗凈的壞處很多。盡管玻璃看似平滑，但是一些細(xì)微的凹陷處會凝結(jié)肉眼無法分辨的膠顆粒 （摸上去疙疙瘩瘩），其壞處是，在該部位極易導(dǎo)致不均勻的膠塊，樣品經(jīng)過該處或電泳散熱不好，條帶變形。如果是RNA的超薄膠，膠板的顆粒會導(dǎo)致局部巨大氣泡，非常難于清除；蛋白膠也會導(dǎo)致一些小氣泡的產(chǎn)生。玻板沒洗凈的另一個壞處是，由中學(xué)物理知識可知，玻璃表面越光滑粘附越牢，未洗凈的玻板會削弱和膠體間的粘附力，拔梳子或邊條時會產(chǎn)生微小的錯動，膠體下部出現(xiàn)大量氣泡（夾在玻板和膠之間，這個關(guān)系不大）；嚴(yán)重的錯動會使上樣時，樣品從膠和玻璃之間的間隙漏光，或者甚至膠和玻板分開。為避免拔梳子時的錯動，可在電泳緩沖液中拔梳子（比水更好，有SDS潤滑）。判斷玻板是否洗干凈，用手摸一下有沒有疙疙瘩瘩的；最好用洗潔精之類，洗衣粉、肥皂都不好用。

6．上樣時，不要把tip深入膠孔過深（或者采用細(xì)的尖端拉長的專用上樣槍頭），可能會錯開膠和玻板， 樣品會泄露。

7． 增加上樣量不一定會提高熒光信號強(qiáng)度。 增加上樣量的后果通常只能是讓你的內(nèi)參粘連，所有的蛋白條帶都扭曲變形。因?yàn)樵黾由蠘恿孔疃嘀荒芴岣邘妆?，而WB靈敏度是以10的幾次冪量級的，所有目的蛋白信號的唯一方案就是IP富集（可特異提高目的蛋白濃度數(shù)百數(shù)千倍，并去除其它雜蛋白干擾）。增加上樣量的另一個壞處是，本來高表達(dá)的蛋白，諸如內(nèi)參，在同樣WB條件下，可能出現(xiàn)熒光灼燒式粹滅（一晃而滅）或者條帶中空。

     以6孔板80%以上匯合度為例，細(xì)胞裂解液通常都是投入200ul（最少80ul，這樣面積     的培養(yǎng)板如果裂解液投入太少，回收時的損失就太大，上樣就很難做到一致），而這種濃度條件下制備的樣品，電泳時上樣量要控制在5-6ul，最少2.5ul，最多10ul，10ul時內(nèi)參基本已經(jīng)開始粘連成一條線，帶型出現(xiàn)波浪紋；當(dāng)然并非不可以多上樣，再多對WB最終的結(jié)果影響不大（沒有的仍然沒有），且條帶都很丑。

8.  SDSPAGE膠配好暫時不用時，需用電泳緩沖液灌滿空間（拔去梳子和底邊邊條后的間隙），用保鮮膜包裹防止液體蒸發(fā)，短期室溫或稍長期4℃保存。個人習(xí)慣為，灌好分離膠用飽和的正丁醇灌滿上層，保鮮膜包裹，次日再灌堆積膠。兩種方案都可以。所以如果預(yù)計(jì)次日工作量較大，可以提前灌好SDS PAGE。

如何監(jiān)控轉(zhuǎn)膜的效率呢？

最先考慮的應(yīng)該是立春紅染色，來發(fā)現(xiàn)此操作不僅增加額外的操作時間，而且不能說明任何問題，于是拋棄之。

首先，立春紅（也包括考染膠）的靈敏度和HRP-ECL體系的靈敏度相差太遠(yuǎn)，即使立春紅染膜無顏色，也無法提示W(wǎng)B結(jié)果會不會失?。既灸z無顏色也不能說明轉(zhuǎn)膜充分了，除非你銀染），你仍然得繼續(xù)后面的操作；相反靶蛋白區(qū)域有顏色，亦無法提示靶蛋白就轉(zhuǎn)膜完全了，也許只是另外一個分子量大小相近的蛋白。因此，無論立春紅染膜失敗或成功，你都必須進(jìn)行后續(xù)的操作。而立春紅染膠不僅增加額外的操作時間，而且增加一輪漂洗的操作，對膜和膜上的蛋白都不好。那么為什么不采用更直觀的預(yù)染marker做轉(zhuǎn)膜監(jiān)控的依據(jù)呢？理論上，同時轉(zhuǎn)膜、顏色是交聯(lián)到蛋白上的，因此顏色有多深表明有多少蛋白轉(zhuǎn)印到膜上，非常直觀、不會增加任何額外的操作（固定marker的上樣量非常必要）。當(dāng)然上面提到針對PVDF膜，由于對小分子截留的局限，顏料分子會在高強(qiáng)度的轉(zhuǎn)印過程中從交聯(lián)的蛋白上脫落并穿過膜（顏料與蛋白交聯(lián)得過深會使整個lane糊掉；太緊（多）可改變蛋白構(gòu)象使遷移率改變。所以多數(shù)情況下顏料和蛋白之間是一種不穩(wěn)定的交聯(lián)，這意味著在某些條件下，顏料會從交聯(lián)的蛋白上脫落，又因?yàn)槟し肿涌讖揭约澳Σ煌镔|(zhì)吸附能力的差異，顏料小分子會輕易穿過膜到濾紙背面，而蛋白則被牢固的截留在膜上），造成轉(zhuǎn)膜過度的假象?，F(xiàn)在你知道有這種局限，要么更換NC膜；要么采用上面提到的非常穩(wěn)定的轉(zhuǎn)膜條件、注意必要的細(xì)節(jié)，就可從根本上忽略掉其對轉(zhuǎn)膜效率的指示，而把預(yù)染的marker僅僅作為一個分子量大小的指針，當(dāng)然同時可確認(rèn)之前的轉(zhuǎn)膜操作無誤（沒有插反電極，放反膜），也可為后續(xù)抗體孵育操作時膜的正反面做必要的提示。

不同公司預(yù)染的marker效果不太相同，一般NEB和invitrogen的常規(guī)分子量預(yù)染marker要上8-10ul，MBI的只要5ul（膠大小20×30cm），Biorad－mini3型（8.2×7.4cm)MBI最低2.5ul轉(zhuǎn)膜后就足夠清晰。

基本原理：利用抗原和抗體的特異性反應(yīng)，檢測目的蛋白；免疫檢測方法可以是直接的和間接的。現(xiàn)在多用間接免疫酶標(biāo)的方法，在用特異性的第一抗體雜交結(jié)合后，再用酶標(biāo)的第二抗體（堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗第一抗體的抗體）雜交結(jié)合，再加酶的底物顯色或者通過膜上的顏色或X 光底片上曝光的條帶來顯示抗原的存在。

A 封閉：

將轉(zhuǎn)印膜取出，用去離子水清洗，TBST洗一次5 min后，加入3%的脫脂牛奶封閉，于室溫封閉1-1.5小時。洗膜1次，10 min；

B 一抗孵育：

一抗（3%脫脂牛奶抗體稀釋液），4℃孵育過夜。洗膜3次，每次10 min；

C 二抗孵育：

二抗?jié)舛龋?%脫脂牛奶抗體稀釋液），室溫孵育1-1.5h。洗膜3次，每次10 min。一般用的二抗都是HRP（辣根過氧化酶）標(biāo)記的；

D 顯影：

WB檢測中顯影的常用方法根據(jù)催化底物不同，可以分為化學(xué)發(fā)光法和底物顯色法；在WB檢測中，常用的酶是HRP（辣根過氧化酶）和AP（堿性磷酸酶）。其中用的較多的是HRP。選用不同底物，出現(xiàn)的結(jié)果也不一樣。