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解螺旋公眾號·陪伴你科研的第1929天 Western blot（WB）是檢測蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)翻譯后修飾的經(jīng)典方法，可在簡單或復雜的生物樣品中提供有關靶蛋白的半定量或定量數(shù)據(jù)。WB步驟復雜，通常包括：蛋白樣本制備→電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→孵育一抗→孵育二抗→顯影→分析。WB任何過程出現(xiàn)Bug均可影響結果的重復性與靈敏度，因此必須注意將WB的每個步驟標準化。今天給大家分享WB各個過程中需要注意的細節(jié)！有效的樣品制備是影響WB可重復性的非常重要的因素。需考慮以下問題：1、靶蛋白是可溶/不可溶蛋白，細胞質(zhì)/膜蛋白？2、溶解的蛋白或其翻譯后修飾的維持是否需要添加額外的緩沖成分(例如洗滌劑、酶抑制劑)？3、蛋白質(zhì)定量的方法是什么，緩沖成分會干擾蛋白定量嗎？BCA蛋白定量檢測法是總蛋白質(zhì)定量的常用方法，其蛋白間差異較考馬斯染料法的更小，但與還原劑、螯合劑不兼容（兼容去垢劑）。
例如，3-(N-嗎啡啉）丙磺酸緩沖液（MOPS緩沖液）適合~75KDa的蛋白質(zhì)，2-(N-嗎啉基)乙磺酸緩沖液(MES緩沖液)適合<36KDa的蛋白質(zhì)。
蛋白質(zhì)的分子量遷移因凝膠類型、濃度和電泳緩沖液的不同而不同。對應情況如下：
例如，PVDF膜或NC膜（0.45μm）。PVDF膜有兩種規(guī)格，0.45μm的膜適用于檢測大于20KDa的蛋白質(zhì)，0.2μm膜適用于小于20的蛋白質(zhì)。PVDF需要在甲醇中浸泡1-2min激活。大于150KDa蛋白可恒壓20V 4度濕轉(zhuǎn)過夜。
（1）高濃度的凝膠有利于小分子量蛋白的分離。一般在目的蛋白離凝膠前沿0.5-1cm時停止電泳，太靠近凝膠前沿易引起邊緣效應。
（2）SDS阻止蛋白與膜的結合，小蛋白更是如此。因此電轉(zhuǎn)液中可以不加SDS。（1） 而甲醇易使SDS從蛋白上脫離，因此適當降低甲醇濃度至10%或更低，防止蛋白沉淀。（2） 降低電轉(zhuǎn)液中甲醇的含量，這樣可以促進凝膠的膨脹，更易于大分子量蛋白的轉(zhuǎn)出。（3） 使用硝酸纖維素膜時，甲醇是必需的。如果是PVDF膜，甲醇可以不必加入電轉(zhuǎn)液，但需要預先用甲醇活化。3、是否應進行膜染色以評估轉(zhuǎn)膜效率？麗春紅染色可在膜上看見清晰、連續(xù)的粉紅色條帶，無白色圈圈出現(xiàn)。轉(zhuǎn)膜不佳時，條帶色淡、有氣泡，甚至無條帶。封閉液中可與固相載體表面的空白位置結合，同樣以機械填補(堆積)和吸附覆蓋的方式結合在膜上。脫脂奶粉成分復雜（多種蛋白質(zhì)的混合物），磷酸化抗體可能會導致背景增加，此外，因為自身含有生物素，不能用于生物素標記的抗體系統(tǒng)。BSA也是非常常用的封閉液，但BSA可能含有IgG或其他血清蛋白等污染，這些蛋白可以與某些抗體產(chǎn)生交叉反應，增加非特異性信號。但需注意，過度封閉也會導致靶蛋白的信號強度變?nèi)?。研究者發(fā)現(xiàn)有些抗體在室溫下孵育2-4小時會產(chǎn)生比在4℃溫育過夜時更強的信號。2、封閉液應該使用什么濃度(例如，2.5%)和什么緩沖液(例如，TBST)？2、一抗對天然蛋白或變性蛋白特異嗎？識別表位序列/區(qū)域是否已知？蛋白質(zhì)分子量不對時蛋白質(zhì)可能存在降解，翻譯后修飾，如糖基化、磷酸化、前體蛋白剪切等。4、是否設置了適當?shù)膶φ找源_定抗體的特異性？使用陽性和陰性對照可以容易地確定抗體的特異性。最好的陽性對照是過表達目標蛋白的純化蛋白質(zhì)或裂解物，而最好的陰性對照是來自敲除動物組織的組織或細胞裂解物。如果無法獲得過表達目標蛋白的純化蛋白或裂解物，許多公司如Aviva Systems Biology，Cell SignalingTechnology和Santa Cruz Biotechnology都可以獲得許多組織和細胞的裂解物，可用作陽性對照（已知靶蛋白在這些組織或細胞中高度表達）。3、是否存在可檢測/過度曝光的信號，如果是，是否需要調(diào)整抗體濃度？1、采用什么顯影方法（化學發(fā)光還是熒光）？3、膜是否可以剝離抗體進行重新檢測？哪種抗體剝離緩沖液最適合我的實驗？1、目的條帶是否在檢測系統(tǒng)的線性范圍內(nèi)？2、哪種量化方法最適合(全泳道或分析單獨目的條帶)？使用內(nèi)參蛋白是歸一化的常用方法，其前提是假定內(nèi)參蛋白在實驗條件下保持穩(wěn)定。內(nèi)參蛋白與目的蛋白與分子量需至少相差5KDa以上。常用內(nèi)參抗體分子量及定位：
IGF-1處理C2C12細胞檢測eEF2水平，發(fā)現(xiàn)不同內(nèi)參蛋白對處理存在變異性：通常WB數(shù)據(jù)以代表性圖像的形式呈現(xiàn)，以反應干預的效果和WB的質(zhì)量。這就存在呈現(xiàn)圖像時的倫理問題，論文中的WB圖像需要準確呈現(xiàn)量化數(shù)據(jù)的結果。WB圖片呈現(xiàn)是學術不端的重災區(qū)，例如來自多個WB的圖像的拼接以形成一個連續(xù)的圖像可能會模糊樣本之間的變化的大小：此外過飽和的WB會導致感興趣的條帶之間沒有明顯的區(qū)別：調(diào)整對比度以遮蔽雜帶（c）、圖像處理以增強、減少或移除條帶（d）也是不被允許的：
一種常見的WB替代方法是使用免疫酶聯(lián)吸附反應（ELISA）來定量目標蛋白(總蛋白或磷酸蛋白)的豐度。相比WB而言ELISA的優(yōu)勢有：樣本容量大（例如96孔板）、靈敏度高、可絕對定量（使用標準品）、耗時短（2-4小時）等。當然ELISA也存在一些問題，例如不同分子量的蛋白質(zhì)無法相互區(qū)分、使用的一抗可能產(chǎn)生虛假高信號、不能進行重新檢測等。另一項新興的技術是使用蛋白質(zhì)芯片來檢測單個樣本中多個目標蛋白質(zhì)的存在，甚至DNA和RNA的潛在蛋白質(zhì)相互作用，并可測量酶的活性。此外，用于蛋白質(zhì)分析和極其精確定量的質(zhì)譜(即LC-MS/MS)的使用正變得越來越廣泛。質(zhì)譜比ELISA和傳統(tǒng)的WB技術都具有明顯的優(yōu)勢，在高靈敏度和寬動態(tài)范圍(0.5-500 ng/μl)下可以區(qū)分多種蛋白質(zhì)亞型。然而質(zhì)譜分析需要高度專業(yè)化、昂貴的設備和技術，在實驗室中使用也越來越常見。質(zhì)譜可與WB聯(lián)用來確認抗體特異性、確定IP后新的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、以及發(fā)現(xiàn)翻譯后修飾等。WB疑難解析 今天給大家分享WB注意事項就到此為止了，希望對大家有所幫助，祝大家一切順利！MishraM, Tiwari S, Gomes AV. Protein purification and analysis: next generationWestern blotting techniques. Expert Rev Proteomics. 2017;14(11):1037-1053.BassJJ, Wilkinson DJ, Rankin D, et al. An overview of technical considerations forWestern blotting applications to physiological research. Scand J Med SciSports. 2017;27(1):4-25.點下“在看”，多根頭發(fā)
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