【Nat Neurosci】一條有故事的X染色體

生物_醫(yī)藥_科研 2019-02-19

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脆性X染色體綜合征(Fragile X syndrome, FXS)，是導致智力障礙最常見的遺傳性因素，也是自閉癥的最高單基因致病因素，發(fā)病率僅次于21-三體綜合征。致病原因是X染色體上Fmr1基因發(fā)生突變，導致維持腦部正常神經傳導的脆性X智力低下蛋白（FMRP）制造量減少或缺乏。臨床表現為智力低下、語言障礙、行為異常、發(fā)育遲緩、面容特殊等，并伴有孤獨癥、自閉癥、癲癇等癥狀。一旦發(fā)病，無有效治療手段，給家庭帶來沉重的心理和經濟負擔。

圖片來源：CDC

2019年2月11日，《Nature Neuroscience》刊登了威斯康星大學麥迪遜分校Zhao Xinyu團隊的最新研究工作[1]，他們發(fā)現了線粒體融合可以改善FMRP缺失導致的神經元發(fā)育受損，Htt可以介導FMRP調控線粒體融合和樹突成熟，提示了FMRP和HTT在FXS發(fā)病機制中的相互作用，提高了人們對該領域的認知。

Zhao Xinyu 圖片來源：

University of Wisconsin-Madison

結果

1、FMRP對神經細胞的成熟過程至關重要

首先，作者通過DCX-Cre^ERT2鼠（DCX啟動子誘導表達Cre酶）、TdT reporter鼠（Cre依賴表達tdTomato紅色熒光蛋白的report鼠）以及Fmr1^loxp/+鼠雜交獲得cKO鼠（tamoxifen誘導條件性敲除FMRP鼠，圖1a）。他們對6周齡的cKO鼠和對照鼠注射tamoxifen（TAM），并取注射后3d、7d、14d、28d、56d（對應于新生神經元發(fā)育的關鍵階段）的組織進行分析[2]（圖1b），發(fā)現TAM誘導Cre重組酶在DCX+細胞中表達，導致FMRP在DCX+細胞中的選擇性缺失（圖1d-e）。

隨后，他們對海馬齒狀回顆粒下層（SGZ）的tdT+細胞數進行量化（圖1c），結果發(fā)現，FMRP的選擇性缺失，使未成熟神經元數量在最初階段有一個短暫的增加，而在發(fā)育成熟的最后階段則顯著性減少，最終導致新成熟神經元數量減少（圖1f-m）。

圖1 FMRP選擇性缺失影響神經元的發(fā)育過程

接下來，作者在FMRP-cKO鼠（Fmr1^loxp/y）和FMRP-cON鼠（Fmr1^loxp-Neo/y）[3]的DG區(qū)注射retro-pDcx-Cre和retro-flip-GFP混合病毒（圖2a-c），結果發(fā)現，與WT鼠相比，注射后28天，cKO鼠的DCX+新生神經元樹突復雜性、總長度、分支點及端點的數量顯著降低；而在cON鼠中，由于FMRP恢復，改善了cON鼠的DCX+神經元樹突形態(tài)的缺陷（圖2d-h）。這提示了在DCX+新生神經元中FMRP的表達對樹突成熟的重要性。

進一步，為了評估未成熟神經元中FMRP缺失對新生神經元突觸傳遞的功能影響，他們在cKO鼠的DG區(qū)注射retro-hSyn-Cre-GFP病毒，4-5周后，記錄GFP+神經元的誘發(fā)動作電位（AP）和微小自發(fā)性興奮性突觸后電流（mEPSCs），結果表明，未成熟神經元中FMRP的缺失會影響其接受興奮性傳遞的能力（圖2i-n）。這些結果提示了，FMRP在神經細胞成熟過程中的重要作用。

圖2 未成熟神經元中FMRP缺失導致神經元發(fā)育受損

2、FMRP缺失影響代謝過程

為了研究FMRP調控新生神經元發(fā)育成熟的分子機制，作者將Fmr1-KO小鼠和Dcx-DsRed轉基因鼠進行雜交[4]。用熒光激活細胞分選技術（FACS）分離小鼠DG區(qū)中的DsRed+細胞后（圖3a,b）。轉錄組學分析出了與代謝相關的差異基因（圖3c,d）。神經代謝高度依賴線粒體功能[5]，作者的研究發(fā)現，從Fmr1-KO鼠分離的海馬神經元中，參與線粒體功能的幾個差異基因的表達水平發(fā)生了變化，為證明這種變化與FMRP缺失有關，他們檢測了硝基酪氨酸水平發(fā)現，與對照組相比，cKO小鼠的tdT+神經元的硝基酪氨酸水平升高（圖3e,f）。

隨后，作者在Fmr1-KO鼠和WT鼠的DG區(qū)注射Retro-pCAG-mitoDsRed病毒來觀察新生神經元中線粒體形態(tài)（圖3g），結果發(fā)現，FMRP缺失的未成熟神經元中線粒體碎片較多（圖3h,i）。這些結果提示了，未成熟神經元中FMRP表達缺失會顯著影響代謝過程，這可能是由線粒體功能障礙引起的。

圖3 FMRP缺失影響代謝過程

3、線粒體融合改善FMRP缺失神經元的成熟過程

接下來，科研人員用mitoDsRed和GFP轉染從Fmr1-KO鼠分離出的神經元，結果發(fā)現，與WT相比，Fmr1-KO鼠神經元中線粒體的縱橫比、膜電位均顯著降低（圖4a-d），這提示了FMRP缺失會損害小鼠神經元線粒體功能。

線粒體可以通過分裂或融合發(fā)生頻繁的形態(tài)學變化[6]，因此他們假設FMRP缺失的神經元線粒體縱橫比降低可能是由于裂變增加或融合減少導致的，隨后作者用光電開關實驗驗證這一假設，即Fmr1-KO鼠神經元中線粒體融合減少（圖4e-h）。

圖4 FMRP缺失的未成熟神經元中線粒體融合受損

進一步，他們用M1（可促進線粒體融合，恢復線粒體管狀網絡結構）處理Fmr1-KO和WT鼠神經元，結果發(fā)現，線粒體融合的恢復顯著改善了FMRP缺乏導致的樹突成熟度受損現象（圖5）。

圖5 增強線粒體融合可改善FMRP缺陷的未成熟神經元

4、HTT缺失導致線粒體融合基因表達減少以及樹突成熟度受損

接下來，作者研究了FMRP調控線粒體融合的機制。他們從BioGRID數據庫中找出最可能參與未成熟神經元線粒體FMRP調控的靶點基因-Htt，隨后，評估了未成熟神經元中HTT蛋白表達、Htt mRNA表達水平，結果發(fā)現，與對照組相比，cKO鼠DG區(qū)中tdT+神經元的HTT免疫染色強度明顯降低（圖6a,b），此外，Fmr1-KO鼠DG區(qū)和原代海馬神經元的Htt mRNA水平均顯著性降低（圖6c,d）。

進一步，作者用慢病毒介導的shRNA感染海馬神經元，干擾Htt，發(fā)現病毒感染神經元HTT的mRNA水平和蛋白水平以及MFN2（線粒體融合蛋白2，介導線粒體外膜融合）和OPA1（視神經萎縮1，介導線粒體內膜融合）的mRNA水平和蛋白水平均顯著降低（圖6e-l），此外，HTT敲低的海馬神經元的樹突狀復雜性、長度以及節(jié)點數量也顯著降低（圖6m-p）。這些數據提示了，未成熟神經元中HTT缺失導致線粒體融合基因表達減少以及樹突成熟度受損，這與FMRP缺失導致的發(fā)育神經元發(fā)育受損表型一致。

圖6 HTT缺失導致線粒體融合基因表達減少以及樹突成熟度受損

5、HTT表達增強可改善FMRP缺失神經元的線粒體融合

為了檢驗Htt降低是否與FMRP缺失神經元中線粒體缺陷有關，作者利用CRISPR/dCas9技術進行內源基因轉錄激活[7]。他們將設計的十條sgRNA靶序列轉染Neuro2A細胞，篩選出能使內源性Htt mRNA水平和HTT蛋白水平表達顯著性增強的sgRNA（圖7a,b）。隨后科研人員用篩選出來的sgRNA和dCas9-V164感染Fmr1-KO和WT鼠原代海馬神經，結果發(fā)現，KO和WT鼠神經元中HTT蛋白表達水平就顯著升高，更重要的是，KO小鼠神經元中HTT水平恢復到WT的水平（圖7d）。此外，內源性Htt基因的激活提高了Fmr1-KO鼠神經元中線粒體的縱橫比、降低了硝基酪氨酸水平（圖7d,f），并改善了神經元的樹突復雜度（圖8a-c）。提示了，HTT是FMRP調控線粒體功能和神經元成熟的核心。

圖7 HTT表達增強可改善FMRP缺失神經元的線粒體融合

6、增強線粒體融合可改善Fmr1-KO小鼠行為缺陷

上述研究發(fā)現M1可以改善Fmr1-KO鼠神經元中線粒體形態(tài)（圖4），接下來，作者利用曠場實驗（圖8e）、定位測試（圖8f）以及社會新奇度測試（圖8g）三種行為學檢測進一步驗證M1可以改善Fmr1-KO鼠的行為缺陷（圖8d-g）。

最后，他們在成年WT小鼠的DG區(qū)注射慢病毒介導的shRNA敲除HTT，并在21天后進行行為學檢測（圖8h）。結果發(fā)現，HTT敲除小鼠表現出空間記憶和交往能力受損，而M1則可以改善這一現象（圖8i-k）。這表明缺乏FMRP或HTT的小鼠行為缺陷可以通過一種促進線粒體融合的化合物來進行修復。

圖8 增強線粒體融合可改善Fmr1-KO小鼠行為缺陷

結論

FXS是一種X連鎖遺傳病，是最常見的遺傳性智力障礙疾病。近年來，人們對FXS的關注逐漸增加。本文借助于大量病毒標記，發(fā)現FMRP缺失神經元的發(fā)育過程受損，而線粒體融合改善這一現象。隨后，使用CRISPR/dCas9技術靶向激活內源性Htt基因后，恢復了Fmr1-KO鼠神經元的線粒體融合以及樹突成熟缺陷。最后行為學檢測發(fā)現線粒體融合可以改善Fmr1-KO鼠的行為缺陷。為FXS的治療提供了理論依據。

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參考文獻：

[1]Xinyu Zhao et al. Reduced mitochondrial fusion and Huntingtin levels contribute to impaired dendritic maturation and behavioral deficits in Fmr1-mutant mice. Nat Neurosci.(2019).

[2]Kempermann, G., Song, H. & Gage, F. H. Neurogenesis in the AdultHippocampus. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 7, a018812 (2015).

[3]Guo, W. et al. Ablation of Fmrp in adult neural stem cells disrupts hippocampus-dependent learning. Nat. Med. 17, 559–565 (2011).

[4]Gao, Y. et al. Integrative single-cell transcriptomics reveals molecular networks defining neuronal maturation during postnatal neurogenesis. Cereb. Cortex 27, 2064–2077 (2017).

[5]Devine, M. J. & Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 19, 63–80 (2018).

[6]Schon, E. A. & Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron 70, 1033–1053 (2011).

[7]Konermann, S. et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature 517, 583–588 (2015).