TDP-43是一個RNA結(jié)合蛋白，其異常的定位、聚集、翻譯后修飾和降解是肌萎縮性側(cè)索硬化癥（ALS）和額顳葉癡呆（FTD）等神經(jīng)退行性疾病的突出病理特征。TDP-43被報道可以發(fā)生液液相分離，但是其相分離的生理學(xué)功能與神經(jīng)元功能的關(guān)系仍不清楚。2021年8月24日University of Nebraska Medical Center藥理學(xué)和實驗神經(jīng)科學(xué)系的Xinglong Wang課題組在Journalof Cell Biology上發(fā)表了題為“Translational regulation in the brain by TDP-43 phase separation[1]”的文章，作者獲得了表達內(nèi)源性相分離缺陷的TDP-43的小鼠模型，研究揭示了TDP-43的液液相分離在腦功能調(diào)節(jié)中的特殊生理作用。

—TDPΔCR小鼠的行為學(xué)和神經(jīng)元功能—

很多研究表明TDP-43 LCD上321到340AA的α-螺旋區(qū)域（CR）對于TDP-43的相分離具有重要影響。作者首先構(gòu)建了外顯子6編碼的該結(jié)構(gòu)缺失的突變小鼠（即TDPΔCR小鼠），新生的TDPΔCR小鼠與WT鼠相似，然而所有純合子TDPΔCR小鼠出生后幾小時內(nèi)死亡，<20%的雜合子小鼠也在前2周因不明原因死亡（圖1D）。除了體重略有下降，幸存的雜合TDPΔCR老鼠與同窩出生的WT在喂養(yǎng)和生存方面沒有明顯區(qū)別（圖1E）。此外，定量分析發(fā)現(xiàn)，CR的缺失并沒有導(dǎo)致TDP-43蛋白和mRNA水平的變化（圖1F、G）。

圖1 TDPΔCR小鼠的構(gòu)建

接下來，作者采用一系列行為測試來評估雜合子TDPΔCR小鼠的行為學(xué)變化。成年或老年雜合子TDPΔCR小鼠的握力、旋轉(zhuǎn)或運動活動沒有異常，表明其運動功能未受干擾。然而，TDPΔCR小鼠在Nestlet-shredding測試和Marble-burying測試顯示出明顯的缺陷，表明重復(fù)的、強迫性的社交行為受損。盡管運動功能沒有變化，雜合子TDPΔCR小鼠在光/暗探索任務(wù)中在光室中表現(xiàn)出極大的活動減少，暗示了雜合子TDPΔCR小鼠的明亮空間類焦慮行為增加。由于TDP-43與癡呆相關(guān)，所以作者進一步評估了TDPΔCR小鼠的認知功能。雖然TDPΔCR小鼠在新物體識別和恐懼條件反射測試中表現(xiàn)與對照組小鼠相似，但在Y迷宮和Barnes迷宮中表現(xiàn)明顯下降，這表明其空間學(xué)習和記憶受損。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，TDP-43的CR缺失會導(dǎo)致大腦相關(guān)的行為缺陷。

以上描述的所有行為變化通常與海馬活動有關(guān)。作者對TDPΔCR小鼠進行高爾基染色，分析海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)，發(fā)現(xiàn)TDPΔCR小鼠海馬CA1錐體神經(jīng)元基底樹突分支、長度和分支復(fù)雜性顯著減少，表明樹突分支受損，樹突分支是與腦功能相關(guān)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成的重要組成部分。同樣，TDPΔCR小鼠海馬CA1神經(jīng)元的樹突棘密度也顯著下降。總體而言，TDPΔCR雜合小鼠與WT相比，神經(jīng)元的組織學(xué)和生理學(xué)存在差異。驗證了TDP-43 CR在腦功能調(diào)節(jié)中的重要作用。

——TDPΔCR小鼠的相分離缺失——

通過對TDPΔCR小鼠大腦神經(jīng)元核內(nèi)的TDP-43進行共聚焦成像，作者驗證了其相分離能力的受損。TDPΔCR雜合小鼠神經(jīng)元細胞核內(nèi)的TDP-43液滴下降了40.5%，而在純合子TDPΔCR小鼠的神經(jīng)元中進一步下降到26.4%，表明TDPΔCR小鼠的TDP-43 相分離受損。

圖2 CR缺失導(dǎo)致TDPΔCR小鼠中TDP-43相分離異常

接著，作者通過透射電鏡分析了TDPΔCR小鼠大腦。發(fā)現(xiàn)TDPΔCR的海馬組織顯示出健康的神經(jīng)元體細胞，然而有更高的核糖體密度（圖3A）?？紤]到核糖體密度與翻譯速率之間的正相關(guān)關(guān)系，作者推測TDPΔCR小鼠的蛋白質(zhì)合成率可能發(fā)生了變化。為了驗證這一假設(shè)，作者采用基于嘌呤霉素與新合成蛋白結(jié)合的SUnSET技術(shù)來測量體內(nèi)整體蛋白的合成（圖3B）。值得注意的是，在TDPΔCR小鼠的大腦中嘌呤霉素結(jié)合多肽大幅增加（圖3C）。這表明TDP-43CR的缺失促進了蛋白質(zhì)合成。這些結(jié)果表明TDP-43相分離可能在翻譯調(diào)控中具有普適作用。

圖3 CR缺失小鼠的翻譯異常

——TDPΔCR小鼠的相分離缺失——

接下來，作者在TDP-43敲除的HEK293細胞中表達TDP-43WT或TDP-43ΔCR突變體，通過質(zhì)譜鑒定了細胞質(zhì)中的相互作用蛋白。分別鑒定出18個和41個與胞質(zhì)TDP-43WT和TDP-43ΔCR相關(guān)的蛋白，其中9個蛋白在TDP-43WT和TDP-43ΔCR沉淀樣品中普遍富集，并主要與翻譯相關(guān)。接著，作者對表達TDP-43WT或TDP-43ΔCR的HEK293細胞進行了coIP。TDP-43ΔCR與Poly(A)-Binding Protein Cytoplas4 （PABPC4）的共沉淀顯著高于TDP-43WT，盡管在Input樣本中PABPC4的水平保持不變（圖4 F）。與野生型相比，TDPΔCR小鼠腦提取物中TDP-43共沉淀的內(nèi)源性PABPC4含量也顯著升高（圖4 G）。值得注意的是，TDP-43同時共沉淀PABPC4、RPS6和RPL7。進一步暗示了TDP-43存在于由翻譯相關(guān)因子組成的蛋白復(fù)合物中。

圖4 CR缺失對翻譯調(diào)控的影響

進一步，作者在TDP-43ΔCR中生成了一系列的缺失突變，發(fā)現(xiàn)刪除99到105的7個殘基（Δ99-105），完全抑制了TDP-43ΔCR或TDP-43WT共沉淀PABPC4和其他結(jié)合伙伴如RPS6和RPL7的能力。通過瞬轉(zhuǎn)表達TDP-43ΔCR顯著提高了蛋白質(zhì)的合成率，而瞬轉(zhuǎn)TDP-43ΔCRΔ99-105則不會。與此一致的是，轉(zhuǎn)染TDP-43ΔCR引起的cap依賴和cap獨立的翻譯增加也被Δ99-105完全抑制（圖5 K）。這些數(shù)據(jù)表明，TDP-43CR的丟失擾亂了其與翻譯過程中涉及的各種翻譯因子的聯(lián)系。

圖5 Δ99-105是TDP-43ΔCR翻譯調(diào)控的關(guān)鍵

——總結(jié)——

綜上所述，這篇文章通過構(gòu)建內(nèi)源性TDP-43缺失CR的小鼠模型，識別出TDP-43 相分離在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯方面可能意想不到的生理功能。這個新的TDP-43ΔCR小鼠模型顯示了大腦相關(guān)的表型，包括社交、情感和認知障礙，但沒有ALS相關(guān)的肌肉萎縮、運動缺陷和癱瘓，不僅有力地支持TDP-43 的相分離在維持腦功能中可能的重要作用，而且還暗示了與ALS無關(guān)的TDP-43在阿爾茨海默病和相關(guān)腦疾病中的發(fā)病機制。

參考文獻：