DNA熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)是一種應(yīng)用非放射性熒光物質(zhì)依靠核酸探針雜交原理在核中或染色體上顯示DNA序列位置的方法。該技術(shù)具有快速、安全、靈敏度高以及探針可長(zhǎng)期保存等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞遺傳學(xué)、腫瘤生物學(xué)、基因定位、基因作圖、基因擴(kuò)增,產(chǎn)前診斷及哺乳動(dòng)物染色體進(jìn)化研究等領(lǐng)域。1969年Gall和Pardue利用放射性同位素標(biāo)記的DNA探針檢測(cè)細(xì)胞制片上非洲爪蟾細(xì)胞核內(nèi)的rDNA獲得成功之后，Pardue等同年又以小鼠衛(wèi)星DNA為模板，利用體外合成的含3H的RNA為探針成功地與中期染色體標(biāo)本進(jìn)行了原位雜交，從而開(kāi)創(chuàng)了RNA-DNA的同位素原位雜交技術(shù)，但是沒(méi)有得到廣泛應(yīng)用。1974年Evans第一次將染色體顯帶技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來(lái)，提高了基因定位的準(zhǔn)確性。1981年，Langer等首次采用生物素標(biāo)記的核苷酸探針(bio-dUTP)成功地進(jìn)行了染色體原位雜交，建立了非放射性原位雜交技術(shù)(Nonisotopic in situ hybridization)，至此，以熒光標(biāo)記的探針在細(xì)胞制片上進(jìn)行基因原位雜交的技術(shù)建立起來(lái)。1985年這項(xiàng)技術(shù)被引進(jìn)到植物。1986年，Cremer與Licher等分別證實(shí)了熒光原位雜交技術(shù)應(yīng)用于間期核檢測(cè)染色體非整倍體的可行性，從而開(kāi)辟了間期細(xì)胞遺傳學(xué)研究。熒光原位雜交技術(shù)原理是將DNA探針用生物素和毛地黃毒苷等熒光染料標(biāo)記，然后將標(biāo)記的探針直接原位雜交到染色體或DNA纖維切片上，再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針?lè)肿犹禺惤Y(jié)合，通過(guò)熒光雜交信號(hào)來(lái)檢測(cè)DNA序列在染色體或DNA纖維上的定位、定性、相對(duì)定量分析。與其他原位雜交技術(shù)相比，熒光原位雜交具有很多優(yōu)點(diǎn)，主要體現(xiàn)在： ①FISH不需要放射性同位素作探針標(biāo)記，安全性高;②FISH的實(shí)驗(yàn)周期短，探針?lè)€(wěn)定性高; ③FISH能通過(guò)多次免疫化學(xué)反應(yīng)，使其雜交信號(hào)明顯增強(qiáng)，從而提高靈敏度，檢測(cè)的靈敏度接近同位素探針雜交;④FISH的分辨率高達(dá)3-20Mb;⑤FISH可以用不同修飾核苷酸分子標(biāo)記不同的DNA探針，再用不同的熒光素分子檢測(cè)不同的探針?lè)肿?，因此可以在熒光顯微鏡下在同一張切片上同時(shí)觀察幾種DNA探針的定位，直接得到它們的相關(guān)位置和順序，從而大大加速生物基因組和功能基因定位的研究。在20世紀(jì)90年代，F(xiàn)ISH在方法上逐步形成了從單色向多色、從中期染色體FISH向粗線期染色體FISH再向fiber-FISH的發(fā)展趨勢(shì)，靈敏度和分辨率也有了大幅度的提高。多色原位雜交(M-FISH)，“M”分別代表“Multicolor”、“Multiplex”和“Multitar get” 3種類(lèi)型。M-FISH的最大特點(diǎn)是：可將多次繁瑣的FISH實(shí)驗(yàn)和多種不同基因的定位在一次FISH實(shí)驗(yàn)中完成。Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰熒光素(AFA)標(biāo)記探針建立了雙色FISH 技術(shù)。1990年Nederlof等提出用3種熒光素探測(cè)3種以上的靶位DNA序列，創(chuàng)建了多色FISH方法。以下五種方法是在多彩色FISH基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)：染色體描繪(chromosome paint ing)、比較基因組雜交(comparative genomic hybridization,CGH)、光譜染色體自動(dòng)核型分析(spectral karyotyping, SKY)、交叉核素色帶分析(cross-species color banding, Rx-FISH)、多彩色原位啟動(dòng)標(biāo)記(multicolor primed in situ labeling, multicolor PRINS) 。
3.2 DNA纖維熒光原位雜交技術(shù)(DNA fiber-FISH)Wiegant等和Heng等首先利用化學(xué)方法染色體進(jìn)行線性化，再以此線性化的染色體DNA 作為載體進(jìn)行FISH，使FISH的分辨率顯著提高，就是最初的纖維-FISH。Parra和Windle(1993)，Heiskanen等(1994)，F(xiàn)lorijn等(1995)，進(jìn)一步改進(jìn)了伸展DNA纖維的方法，使DNA纖維的伸展程度從最初的80kb/μm達(dá)到了現(xiàn)在的2.5-3.5kb/μm，這一數(shù)值與Watson-Crick建立的DNA雙螺旋模型中B-DNA分子的理論值2.97kb/μm十分接近，因此可以說(shuō)現(xiàn)在得到的DNA纖維基本上是裸露的雙螺旋DNA分子。纖維-FISH的關(guān)鍵就在于何制備高質(zhì)量的線性DNA纖維纖維-FISH具有高分辨率,能進(jìn)行定量分析，模板要不高，只需分析少量的DNA分子(<10個(gè))，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)由于纖維-FISH的這些優(yōu)點(diǎn)使得它在染色體圖譜繪制，基因重組研究以及臨床染色體基因序列檢測(cè)工作中起著十分重要的作用。3.3. 組織微陣排列技術(shù)(tissue microarray)Microarray可以在1次實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)出數(shù)百個(gè)基因在1個(gè)細(xì)胞中的表達(dá)情況(包括降低和增高)。Tissue array則在1次實(shí)驗(yàn)中能檢測(cè)出1個(gè)基因在數(shù)百個(gè)細(xì)胞中的表達(dá)情況。Tissue microarray是由Tissue microarray區(qū)域中500-1000單個(gè)腫瘤組織聯(lián)合筒狀活檢構(gòu)成的，將活檢組織切成200多片用于DNA、RNA探針。單個(gè)雜交提供單個(gè)載玻片上所有樣本的信號(hào)，以后的切片可以用其他探針或抗體分析。同一個(gè)組織樣本切片的多重疊區(qū)域可以形成數(shù)千張切片[6]。組織和cDNA微陣排列技術(shù)相結(jié)合提供一種有力的體內(nèi)鑒定基因的方法，可以對(duì)癌或其他疾病的分子改變做出重要評(píng)估。3.4 熒光免疫核型分析和間期細(xì)胞遺傳學(xué)(fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics, FICTION)FICTION是1種將免疫核型分析和原位雜交相結(jié)合的方法，這種方法可以同時(shí)顯示異種細(xì)胞群中單個(gè)腫瘤細(xì)胞的免疫表型和一定的基因改變。FICTION形態(tài)學(xué)有關(guān)，可以對(duì)檔藏材料作回顧性研究。FICTION診斷快速，可以再現(xiàn)，適合FISH分析前或后沒(méi)有所需以前細(xì)胞標(biāo)本的細(xì)胞學(xué)樣本。FICTION可用于分析血液腫瘤的系譜以獲得對(duì)腫瘤病理組織更好的了解。FISH技術(shù)已經(jīng)在細(xì)胞遺傳學(xué)、腫瘤生物學(xué)、基因定位、基因作圖、基因擴(kuò)增、產(chǎn)前診斷及哺乳動(dòng)物染色體進(jìn)化研究等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。4.1染色體結(jié)構(gòu)變異與非整倍體的檢測(cè)熒光原位雜交簡(jiǎn)化了染色體結(jié)構(gòu)變異的檢測(cè)。如植物染色體的非整倍體是由于染色體行為異常，即可能是雙親配子染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)差異引起或染色體親緣關(guān)系較遠(yuǎn)等因素導(dǎo)致。利用原位雜交可比較容易地檢測(cè)出缺失、附加或替換的染色體。FISH空間分辨率和敏感性使得親本和擴(kuò)增基因在抗病蟲(chóng)害細(xì)胞中定位成為可能。被擴(kuò)增基因主要在同一染色體臂上，但離初始親本基因有一定距離，且經(jīng)常獨(dú)立地位于染色體端粒部位;FISH分析表明細(xì)胞斷裂可能是由于染色體含有擴(kuò)增區(qū)域的結(jié)構(gòu)重排。同時(shí)用FISH 可定位轉(zhuǎn)基因植物中外源基因位置和拷貝數(shù)，此法在番茄、煙草、大麥、小麥、黑麥等作物中已獲成功。利用FISH技術(shù)也可檢測(cè)一些與遺傳性疾病相關(guān)的基因缺失，如成功檢測(cè)了aniridia疾病(一種虹膜缺失的罕見(jiàn)遺傳異常疾病)患者的缺失基因。熒光原位雜交的基因定位技術(shù)有著廣泛的應(yīng)用。PP2Ac突變型肺癌相關(guān)基因在染色體區(qū)域的定位，熒光顯微鏡下觀察記錄和分析雜交信號(hào)的特征。結(jié)果在正常人淋巴細(xì)胞的染色體5q23-31可見(jiàn)明顯雜交信號(hào)，在GLC-82細(xì)胞的5號(hào)和7號(hào)染色體上出現(xiàn)較強(qiáng)信號(hào)。說(shuō)明點(diǎn)突變引起PP2Ac活性改變，從而基因易位，導(dǎo)致肺腫瘤的產(chǎn)生。FISH技術(shù)與生化、計(jì)算機(jī)和重組DNA技術(shù)結(jié)合檢測(cè)Alu位點(diǎn)，表明DNA序列與帶型有關(guān)。用FISH技術(shù)對(duì)人類(lèi)基因組中編碼基因分布的研究揭示，基因主要集中在染色體上G C(占全基因組35% )最豐富的DNA區(qū)段。FISH技術(shù)為著絲粒結(jié)構(gòu)研究提供了重要手段。應(yīng)用FISH技術(shù)可直接觀察染色體端粒，這簡(jiǎn)化了染色體在核內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能研究。用FISH技術(shù)可直接檢測(cè)DNA在染色體上的位置，所確定位置是基因在染色體上實(shí)際的物理位置。由于原位雜交不受位點(diǎn)內(nèi)變異和位點(diǎn)間拷貝數(shù)的影響，F(xiàn)ISH技術(shù)已成為重復(fù)序列和多基因家族作圖的重要手段，如M.C lark等用熒光原位雜交方法在大麥第5號(hào)染色體制作出B-醇溶蛋白位點(diǎn)的物理圖譜。多色探針標(biāo)記為探針定位提供了一種更簡(jiǎn)便的方法。如檢測(cè)時(shí)2個(gè)探針用紅色，第3探針用綠色，則綠色位點(diǎn)的位置要么在2紅色位點(diǎn)之外，要么在它們之間，于是可確定探針順序。因此，探針被至少20kbp的序列隔開(kāi)就可以用FISH技術(shù)將之定位。FISH技術(shù)最先在美國(guó)用于產(chǎn)前診斷，早在1993年FISH技術(shù)就被美國(guó)遺傳學(xué)會(huì)(ACMG)允許用于產(chǎn)前輔助診斷，最終的確診還需要依賴(lài)核型分析。而到2000年鑒于FISH技術(shù)具有高度的敏感性和特異性，ACMG宣布FISH技術(shù)可以用于常見(jiàn)染色體數(shù)目異常的確診，而不再僅僅作為輔助性產(chǎn)前診斷手段。在2001年，Tepperberg等對(duì)FISH技術(shù)進(jìn)行快速產(chǎn)前診斷的結(jié)果與核型分析結(jié)果進(jìn)行了大樣本比較，共47312份有效標(biāo)本中，F(xiàn)ISH法僅有9例出現(xiàn)了假陽(yáng)性結(jié)果，假陽(yáng)性率為0.019%，有32例出現(xiàn)了假陰性結(jié)果，假陰性率為0.049%。FISH進(jìn)行快速產(chǎn)前診斷具有非常高的靈敏度和特異度，可以用于常見(jiàn)的染色體數(shù)目異常的診斷。此后，F(xiàn)ISH技術(shù)在一些發(fā)達(dá)國(guó)家被廣泛用于快速產(chǎn)前診斷。FISH適用于多種標(biāo)本：如羊水細(xì)胞、絨毛細(xì)胞、胎兒有核紅細(xì)胞及著床前胚胎卵裂細(xì)胞等，且不僅適用于中期染色體，也適用于間期核及細(xì)胞周期的所有階段。FISH的突出優(yōu)點(diǎn)是可快速得出結(jié)果，與歷時(shí)7～12 d的細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行傳統(tǒng)染色體顯帶分析相比，F(xiàn)ISH可在24～48 h內(nèi)完成，減少染色體病篩查試驗(yàn)陽(yáng)性患者在焦慮中的等待時(shí)間，讓臨床醫(yī)生盡早做出診斷，制定進(jìn)一步診療方案。與放射性原位雜交相比較，F(xiàn)ISH技術(shù)無(wú)放射性同位素污染，不需要特殊的安全防護(hù)，且敏感性與同位素檢測(cè)相當(dāng)，完全可以取代放射性原位雜交而成為一種新的檢查方法。染色體的主要成分包括DNA和組蛋白，除此之外，還有非組蛋白和RNA。對(duì)這些物質(zhì)在染色體中分布進(jìn)行精確定位是研究染色體高級(jí)結(jié)構(gòu)和構(gòu)建染色體模型的關(guān)鍵所在。人們對(duì)染色體中DNA和蛋白質(zhì)研究已比較深入，但對(duì)染色體中RNA的性質(zhì)、種類(lèi)、來(lái)源、分布特點(diǎn)及生物學(xué)功能缺乏深入研究。宋林生等用生物素標(biāo)記的玉米18s、rRNA小麥5s rRNA及tRNA的cDNA作為探針，利用玉米根尖超薄切片進(jìn)行原位雜交，證實(shí)玉米染色體中既有來(lái)自核仁的rRNA或其前體，又含有來(lái)自核基質(zhì)的rRNA、5s rRNA或hnRNA (核內(nèi)不均一RNA)，揭示了染色體中RNA的種類(lèi)和來(lái)源。血液腫瘤是我國(guó)十大高發(fā)腫瘤之一，隨著對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞遺傳學(xué)對(duì)腫瘤分型、診斷、治療和預(yù)測(cè)預(yù)后都具有重要的意義。在臨床上對(duì)血液腫瘤的FISH檢測(cè)主要集中在以下幾個(gè)方面：①染色體異位形成的融合基因檢測(cè)。②基因缺失的檢測(cè)。一些關(guān)鍵基因的缺失有助于我們對(duì)腫瘤進(jìn)行診斷以及預(yù)后判斷。③微小殘留病灶的檢測(cè)。④對(duì)異性間造血干細(xì)胞移植的植入狀態(tài)監(jiān)測(cè)。FISH幾乎可以快速檢測(cè)任何類(lèi)型組織細(xì)胞的染色體異常，不管組織是新鮮的或是一些甲醛溶液(福爾馬林)固定的陳舊組織標(biāo)本。因此，F(xiàn)ISH被廣泛接受用于乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、肺癌、淋巴瘤等實(shí)體瘤的輔助診斷，其目的主要集中在對(duì)腫瘤的早期診斷、療效檢測(cè)、個(gè)體化治療和預(yù)后判斷等幾個(gè)方面。總之，F(xiàn)ISH技術(shù)在臨床中的應(yīng)用已經(jīng)得到迅速的發(fā)展，靈敏度和特異度明顯改善，可供選擇的商業(yè)化探針也越來(lái)越多。但是，由于目前儀器設(shè)備和探針價(jià)格過(guò)于昂貴，以及對(duì)于操作人員技術(shù)水平要求也較高，在一定程度上限制了FISH 技術(shù)在臨床上的應(yīng)用。特別是在我國(guó)，僅有一些大醫(yī)院開(kāi)展了FISH項(xiàng)目，檢測(cè)范圍也僅限于血液性腫瘤、乳腺癌以及產(chǎn)前診斷方面，其他檢測(cè)項(xiàng)目開(kāi)展較少。因此，在今后的一段時(shí)間，為了使FISH得到更廣泛的應(yīng)用，怎樣降低成本，簡(jiǎn)化操作步驟仍是科研人員面臨的一個(gè)難題。
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