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隨著使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)生物制劑需求量的提高，10000-25000L大規(guī)模的生物反應(yīng)器已投入使用，與1-5L的臺式生物反應(yīng)器相比，大規(guī)模生物反應(yīng)器對溶液混合、氣體轉(zhuǎn)移和流體動(dòng)力學(xué)等方面的要求也更嚴(yán)格。與發(fā)酵罐一樣，溶解氧（DO）和pH梯度會隨著生物反應(yīng)器規(guī)模的增大而增加，其主要原因在于大規(guī)模生物反應(yīng)器需要更長的混合時(shí)間。除此之外，大規(guī)模生物反應(yīng)器還需要頻繁的補(bǔ)加堿試劑，由于補(bǔ)加過程混合不充分會出現(xiàn)顯著的pH偏移現(xiàn)象，這種現(xiàn)象可能會影響細(xì)胞的生長、活力與抗體質(zhì)量，為了更好的了解這些參數(shù)的影響，這篇文章作者提供了pH偏移對三種CHO細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)性能和抗體N端糖基化影響的研究結(jié)果。 在這項(xiàng)研究中，研究人員使用了三種重組CHO細(xì)胞系（細(xì)胞系1，2，3）用于產(chǎn)生IgG1和IgG4抗體，使用的生物反應(yīng)器為ambr?250，每天從生物反應(yīng)器中采集樣品進(jìn)行檢測，檢測項(xiàng)目有： （1）通過ABL80血?dú)夥治鰞x檢測pH、pO2和pCO2； （2）使用臺盼藍(lán)染料和Cedex Hi-Res細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測活細(xì)胞密度（VCD）和活力；（3）在RX Imola分析儀上檢測葡萄糖、乳酸鹽和谷氨酰胺等濃度； （4）使用Advanced Model 2020 Micro Osmometer 檢測樣品滲透壓； 結(jié)束培養(yǎng)后，將細(xì)胞培養(yǎng)液離心，獲得目的抗體，使用高效液相色譜檢測上清液中抗體效價(jià)，另外，通過N-聚糖酶從抗體上分離聚糖并用UPLC BEH聚糖柱進(jìn)行分離檢測。 為了模擬工藝中典型的堿添加百分比和持續(xù)時(shí)間，研究人員從第2天至第8天額外添加1N NaOH。設(shè)計(jì)3種添加比例：2%、4%和6%的生物反應(yīng)器初始體積；使用兩種堿添加的方法：液體處理器多次推注、ambr?250系統(tǒng)泵控制的連續(xù)添加，由于每次推注的堿量是固定的，所以4%和6%體積的劑量需要2次和3次推注。如圖1所示，推注添加導(dǎo)致頻繁的pH偏移，并且pH偏移的頻率隨著添加的堿量而增多，而連續(xù)添加pH變化較為平緩。研究人員進(jìn)一步研究其對細(xì)胞培養(yǎng)性能的影響，如圖2所示，推注添加堿的方式對細(xì)胞培養(yǎng)性能有負(fù)面影響，并且隨著堿添加量的增加而增大，在6% 1N NaOH條件下觀察到細(xì)胞生長受到顯著抑制，活力下降速度加快。推注添加中葡萄糖的消耗和乳酸的產(chǎn)量也相對較高。 基于堿添加的實(shí)驗(yàn)條件，研究人員發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中的滲透壓隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增大，于是設(shè)計(jì)了兩種單獨(dú)滲透壓濃度（+75mOsm/kg和+170mOsm/kg），通過第2-8天推注添加1M NaCl的方法進(jìn)行調(diào)節(jié)，考察滲透壓濃度對細(xì)胞培養(yǎng)的影響，對照組滲透壓使用生物反應(yīng)器控制自動(dòng)調(diào)節(jié)。如圖2所示，雖然最高滲透壓調(diào)節(jié)濃度為+170mOsm/kg，但能達(dá)到的最終質(zhì)量摩爾滲透壓濃度為520 mOsm/kg，兩種高滲透壓條件下均觀察到細(xì)胞生長受到抑制。 研究人員通過在pH6.70-7.30范圍內(nèi)設(shè)定不同pH條件培養(yǎng)CHO細(xì)胞系1（圖3），研究培養(yǎng)基pH值對細(xì)胞培養(yǎng)性能的影響。其結(jié)果顯示： （1）對細(xì)胞生長的影響：pH≤6.80需要頻繁的補(bǔ)充CO2且pCO2保持較高的水平，在pH6.70條件下，細(xì)胞生長緩慢；pH6.80-6.90條件下活細(xì)胞密度達(dá)到最高，而在此pH范圍之外，活細(xì)胞密度均降低； （2）對葡萄糖消耗率和乳酸產(chǎn)生率的影響：如圖4所示，pH6.70-6.90之間，兩者沒有明顯的改變，當(dāng)pH > 6.90時(shí)，葡萄糖消耗率和乳酸產(chǎn)生率隨著pH升高而增加，其結(jié)果表明細(xì)胞生長可能更依賴于糖酵解產(chǎn)生的能量，因?yàn)樘墙徒膺^程在高pH下能快速地產(chǎn)生乳酸； （3）對活細(xì)胞密度和抗體效價(jià)的影響：當(dāng)pH > 7.00時(shí)，雖然葡萄糖消耗增多，但活細(xì)胞密度卻減少、抗體效價(jià)也逐漸降低； （4）研究人員通過研究pH與乳酸峰值之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)（圖5），主動(dòng)和被動(dòng)的堿添加方式產(chǎn)生的乳酸水平相似，所以乳酸產(chǎn)量可能與培養(yǎng)基中pH有關(guān)，所以應(yīng)結(jié)合pH偏移和培養(yǎng)基中pH值對細(xì)胞性能影響的結(jié)果優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案。 pH偏移對N-糖基化譜的影響：N-糖基化結(jié)構(gòu)由糖基化酶催化而形成，已有研究發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞系和培養(yǎng)條件均會影響N-聚糖的形成，導(dǎo)致產(chǎn)生不同的N-糖基化抗體。文章中主要研究了細(xì)胞系1單克隆抗體典型的糖基化結(jié)構(gòu)，主要包括巖藻糖基化的雙天線糖基，帶有可變的半乳糖基化結(jié)構(gòu)（G0F、G1F、G2F）,以及幾種高甘露糖結(jié)構(gòu)。如圖6所示，G0F糖型> 70%，其次是G1F+G2F，高甘露糖結(jié)構(gòu)（HM）含量最少，低于5%。研究發(fā)現(xiàn)，隨著滲透壓濃度的增大，會增加HM糖型，G1F+G2F糖型減少；而隨著堿量的增加，HM和 G1F+G2F糖型均會增加，在堿添加量相同的基礎(chǔ)上，推注添加比連續(xù)添加產(chǎn)生的G1F+G2F糖型都要高。 培養(yǎng)基pH值對N-糖基化譜的影響：如圖7所示，pH6.90-7.10的范圍內(nèi)，G1F+G2F糖型隨著pH的升高而增加，與圖6相符和的是，在不同pH培養(yǎng)的條件下，不同添加堿量的方式都會增加G1F+G2F糖型。研究還提出了細(xì)胞生產(chǎn)力與N-糖基化糖型可能存在的關(guān)系，如圖7所示，細(xì)胞生產(chǎn)力較低時(shí)，G1F+G2F糖型增多，其可能原因是生產(chǎn)力低的細(xì)胞能長時(shí)間充分暴露內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中用于翻譯后修飾的酶，導(dǎo)致半乳糖糖基合成水平升高。 用產(chǎn)生單克隆抗體的CHO細(xì)胞系2和細(xì)胞系3進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示細(xì)胞培養(yǎng)性能發(fā)生的變化與細(xì)胞系1相似：推注添加堿會導(dǎo)致pH偏移；提高培養(yǎng)基pH值，會增加乳酸產(chǎn)量和滲透壓、降低細(xì)胞生產(chǎn)力（圖8）；提高培養(yǎng)基pH值和降低細(xì)胞生產(chǎn)力，均會增加G1F+G2F糖型（圖9）。值得注意的是，研究人員發(fā)現(xiàn)pH偏移對細(xì)胞系2和細(xì)胞系3的N-糖基化沒有實(shí)質(zhì)性影響，不同添加堿的方式導(dǎo)致的G1F+G2F糖型變化范圍≤5%，不到細(xì)胞系1的一半。 總結(jié)：上述研究結(jié)果顯示pH偏移會影響細(xì)胞培養(yǎng)性能，乳酸產(chǎn)量增加的主要原因是培養(yǎng)基pH值的升高，補(bǔ)充堿試劑導(dǎo)致pH偏移，進(jìn)一步提高了乳酸的產(chǎn)量。除此之外，對于研究的CHO細(xì)胞系1，pH偏移對抗體N-糖基化譜有著顯著的影響。隨著生物反應(yīng)器規(guī)模的增大，堿試劑加入次數(shù)和混合時(shí)間隨之增多，增加了pH偏移機(jī)率，為了提高細(xì)胞培養(yǎng)性能，優(yōu)化產(chǎn)品質(zhì)量，對于大規(guī)模生物反應(yīng)器，優(yōu)化pH控制回路、設(shè)計(jì)合適的堿添加頻率使基礎(chǔ)培養(yǎng)基充分混合十分關(guān)鍵。 參考文獻(xiàn)：Rubin Jiang, Hao Chen, Sen Xu. pH excursions impact CHO cell culture performance and antibody N-linked glycosylation. Bioprocess and Biosystems Engineering.2018(07) 培訓(xùn)推薦 新藥研發(fā)項(xiàng)目篩選與立項(xiàng)及綜合信息挖掘?qū)崙?zhàn)分析 上海“藥企如何開展臨床前安全性研究專題（ICH S指導(dǎo)）” 藥品制造生產(chǎn)智能化建設(shè)研究與應(yīng)用探討 |
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