干細胞具有自我更新和分化為特定細胞的能力，并由其來源和分化程度來定義干細胞類型。多能干細胞能夠無限制的自我更新和分化為體內(nèi)200多種細胞中的任何一種。多能干細胞總共有兩個來源。首先，胚胎干細胞(ESCs)是由著床前囊胚內(nèi)細胞團衍化而來，其多能性由包括核心轉(zhuǎn)錄因子、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(OCT4)、性別決定區(qū)域Y-方框2(SOX 2)和抑制性突變體同源框(NANOG)的內(nèi)在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。第二，誘導(dǎo)的多能干細胞(IPSCs)是通過異位或升高表達對于誘導(dǎo)體細胞多能性必不可少的4種轉(zhuǎn)錄因子而獲得的：OCT4，SOX2，Kruppel樣因子4(KLF4)，和MYC原癌基因(C-MYC)。

另一種類型的干細胞，間充質(zhì)干細胞(MSCs)是從成人中如骨髓和脂肪組織或圍產(chǎn)期組織，例如臍帶、臍帶血、胎盤和羊水等來源中分離出來的。MSCs以在塑料培養(yǎng)板上貼壁生長為特征，表現(xiàn)出克隆性生長。它們對間充質(zhì)細胞表面標記物、CD 90、CD 73、CD 29和CD105表現(xiàn)陽性，對造血系標記物、CD 45、CD 34和HLA-DR表現(xiàn)陰性。與多能干細胞不同，間充質(zhì)干細胞是多向潛能的，只分化為有限的細胞類型，如成骨、軟骨和脂肪細胞。此外，其自我更新和分化潛力取決于其分離來源。此外，來自成人組織的間充質(zhì)干細胞也會受到老化和可能改變遺傳穩(wěn)定性的環(huán)境壓力的影響。與成人MSCs相比，從圍產(chǎn)期組織中獲得的MSCs具有更高的生長和干細胞生長潛力。

因此，對干細胞的研究有助于闡明基本的生化和發(fā)育過程。他們也在體外疾病模型，組織工程學(xué)，再生醫(yī)學(xué)和細胞治療，以及藥物應(yīng)用方面顯示出巨大的潛力。并且，干細胞還可用于藥物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)。所有這些用途都需要高質(zhì)量細胞的大規(guī)模生產(chǎn)。

傳統(tǒng)上，干細胞在二維(2-D)塑料培養(yǎng)板中以單層的形式擴增，常常需要未知或異種材料，包括但不限于附著基體，細胞因子和生長因子，以及血清。使用異源或動物源培養(yǎng)基可以潛在地傳播病原體，并且由于所用材料批次差異，其培養(yǎng)重復(fù)性受限。

單層培養(yǎng)需要通過常規(guī)傳代來保持細胞的自我更新和潛能，這對于細胞的大規(guī)模擴張是非常低效率的。此外，二維附著改變了細胞的形狀和幾何結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞變扁和細胞內(nèi)細胞骨架和細胞核形態(tài)的改變，這反過來又改變了基因和蛋白質(zhì)的表達。已有研究發(fā)現(xiàn)，細胞外基質(zhì)(ECM)的組成和成分也能發(fā)出促進細胞分化的生化和機械信號。

2-D培養(yǎng)技術(shù)和其應(yīng)用已在大多數(shù)原始和已建立的細胞系中得到實踐，并標準化用于從顯微鏡使用和細胞計數(shù)到研究疾病進程和藥物檢測范圍內(nèi)的分析性試驗。值得注意的是，2-D培養(yǎng)已經(jīng)被用于定向分化干細胞成多種特定細胞，包括成軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞，平滑肌細胞和肝細胞。然而，二維培養(yǎng)往往導(dǎo)致功能衍生物的缺失。研究還表明，二維單層培養(yǎng)不能準確再現(xiàn)動物生理學(xué)，并證明不足以驗證藥物發(fā)現(xiàn)。

總之，二維培養(yǎng)條件缺乏模擬干細胞微環(huán)境、動態(tài)和特定的三維(3D)微環(huán)境所需的復(fù)雜程度，而微環(huán)境負責調(diào)控體外干細胞的走向。在體內(nèi)原生的三維微環(huán)境允許細胞、胞外基質(zhì)組分和梯度營養(yǎng)、氧氣、廢物之間復(fù)雜的空間相互作用。三維微環(huán)境的影響是可以輕易在多能性干細胞中得到闡釋：當注入另一個胚胎的內(nèi)細胞團時，仍保持多能性，但由于外部誘因，在注射到動物其他部位時，干細胞自發(fā)分化為三個胚層。此外，在活體性腺、腸隱窩、毛囊和體內(nèi)骨髓中也發(fā)現(xiàn)了支持多能干細胞的微環(huán)境，在此環(huán)境下，受體細胞釋放信號控制多能干細胞持續(xù)自我更新或種系特異性分化。憑借體內(nèi)微環(huán)境中的誘因，多能干細胞移植出微環(huán)境將導(dǎo)致其分化為不同細胞系的細胞。

為了解決干細胞二維培養(yǎng)所面臨的各種問題，開發(fā)了三維培養(yǎng)方法，通過體外模擬干細胞微環(huán)境的胞外基質(zhì)的組成和稠度將生理相關(guān)性和仿生微環(huán)境相結(jié)合來控制細胞的命運。然而，三維培養(yǎng)干細胞的維持和擴大仍然是一個挑戰(zhàn)，主要是因為需要為不同類型的細胞進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化和分析。因此，闡明重要的干細胞維持機制是有必要的，包括有助于干細胞進行均勻和可持續(xù)擴增的同時不喪失遺傳穩(wěn)定性或分化潛能的生物材料信號傳遞和機械力。

近年來三維培養(yǎng)擴增干細胞，在數(shù)量和質(zhì)量上已能夠用于臨床、制藥和生物技術(shù)應(yīng)用，本文聚焦在這些方面的進展。此外，我們將報告近期在二維培養(yǎng)方面的一些重要進展，因為這些技術(shù)在歷史上導(dǎo)致了干細胞生物學(xué)的重大發(fā)展，并對早期的研究進行了回顧?？偟膩碚f，本文綜述了多能干細胞的增殖和分化方面的最新進展。 

2.1 多能干細胞的維持與分化 

2-D培養(yǎng)研究聚焦在未分化干細胞特有的自我更新狀態(tài)-干性的維持上，維持通過外部因素進行，如細胞及其三維微環(huán)境間的機械力，可以轉(zhuǎn)換成能夠控制細胞形態(tài)和功能的生物線索。

多能干細胞通常生長在涂有幫助附著的細胞外基質(zhì)成分(如明膠、基質(zhì)膠或膠原蛋白)或小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)飼養(yǎng)層的塑料培養(yǎng)皿上。小鼠胚胎干細胞可通過在小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層或含有小鼠胚胎成纖維細胞釋放的細胞因子-白血病抑制因子（LIF）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)來維持它們的多能狀態(tài)。然而，補充白血病抑制因子不足以維持人胚胎干細胞的多能性，還需要在培養(yǎng)基中添加成纖維細胞生長因子2(FGF-2)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)。最近的證據(jù)表明，這些差異不是物種特異性的，而是發(fā)育差異性的。例如，人類胚胎干細胞和小鼠外胚層干細胞表現(xiàn)為扁平形態(tài)和低克隆性，而小鼠胚胎干細胞表現(xiàn)為三維凸圓形態(tài)，且單細胞克隆生長良好。最近的研究表明，通過在培養(yǎng)基中加入ROCK抑制劑以保護單個細胞免受凋亡從而提高細胞的增殖。已經(jīng)提出在胚胎發(fā)育中有兩個連續(xù)的多能狀態(tài)，一個早期原始狀態(tài)，之后是活化狀態(tài)，各自派生出小鼠胚胎干細胞和人胚胎干細胞。原始多能干細胞是一種早期全能細胞，能夠分化為胚胎外組織和胚胎組織，而活化細胞來自于發(fā)育更高的狀態(tài)，只分化為胚胎組織。

事實上，最近的研究已經(jīng)證明人類胚胎干細胞在多能性上有能力從活化狀態(tài)恢復(fù)到原始狀態(tài)，這將大大提高人多能干細胞在培養(yǎng)時的增殖能力。此外，以下途徑提高了胚胎干細胞的二維擴張： 

使用成分明確和無異質(zhì)的培養(yǎng)基和附著基質(zhì)，分別如E8培養(yǎng)基和人源重組蛋白玻連蛋白。然而，由于二維培養(yǎng)方法擴增多能干細胞費力，成本昂貴，而且需要高水平的專業(yè)知識，所以多能干細胞的均衡擴張仍然難以實現(xiàn)。

多能干細胞可分化為來源于所有三個胚層的細胞類型。一般來說，二維培養(yǎng)條件有利于多能干細胞的非特異性分化。然而，通過控制胞外基質(zhì)、生長因子和附著基質(zhì)的組成和組織，多能干細胞可以定向分化到特定的細胞系，這些物質(zhì)可以發(fā)出決定細胞命運的機械信號。胚胎干細胞和誘導(dǎo)多能干細胞都可以使用類似的方案進行分化，但是，由于體細胞的本性和用于產(chǎn)生多能干細胞的方法，誘導(dǎo)多能干細胞表現(xiàn)出更大的變異性。在單層培養(yǎng)中使用特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，胚胎干細胞已被定向分化為外胚層、中胚層和內(nèi)胚層細胞類型，包括成熟的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，成骨細胞，心肌細胞，肝細胞。單層培養(yǎng)的一個巨大優(yōu)勢是它允許對細胞的分化進行均勻的處理。因此，在利用合成基質(zhì)進行二維培養(yǎng)和逐步地受控分化人類胚胎干細胞方面均取得了進步。例如，在單層培養(yǎng)中，使用MEF條件培養(yǎng)液然后再用激活素A和骨形成蛋白處理，胚胎干細胞被預(yù)先分化為包括心肌細胞的中胚層細胞類型的效率約為30%。不過，補加糖原合成酶激酶3和Wnt抑制劑可使胚胎干細胞向心肌細胞分化效率變?yōu)榧s80%-90%。同樣地，分步策略也被用來分化胚胎干細胞，先分化為內(nèi)胚層細胞，肝祖細胞，然后利用特定的生長因子分化為肝細胞。同樣，使用補充了sonic hedgehog 蛋白拮抗劑以形成皮質(zhì)樣神經(jīng)元的神經(jīng)分化培養(yǎng)基，小鼠胚胎干細胞也被分化為外胚層細胞類型。 

然而，分化的神經(jīng)元是異質(zhì)性的，在體外不能顯示特定的神經(jīng)元特征。盡管分化較快，但二維培養(yǎng)的胚胎干細胞分化時往往獲得分化細胞的混合群體。

2.2 骨髓間充質(zhì)干細胞的維持與分化

與多能干細胞不同的是，骨髓間充質(zhì)干細胞是自然粘附的，不需要異種基質(zhì)來附著在培養(yǎng)板上，盡管它們通常是在含有動物血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。然而，最近，無異種物質(zhì)的特定培養(yǎng)基已可用于擴大培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞。當培養(yǎng)基添加可溶性因子時可以保持胚胎干細胞的干性，而確切的骨髓間充質(zhì)干細胞自我更新的機制尚不清楚。然而，模擬體內(nèi)的微環(huán)境，如缺氧(2%O2)，已被證明能增強骨髓間充質(zhì)干細胞的干性，引起細胞顯著增殖，而且在6周培養(yǎng)期內(nèi)不喪失多樣性分化潛能。 

骨髓間充質(zhì)干細胞在二維培養(yǎng)中的擴增效率很低。通常，細胞擴增是在多個組織培養(yǎng)瓶中生長以增加骨髓間充質(zhì)干細胞大規(guī)模附著和繁殖的表面積。均勻的分布、生長和收獲過程對于最大限度地減少異質(zhì)性和提高細胞產(chǎn)量都很重要。在體外成功地培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞需要了解影響這些細胞增殖和誘導(dǎo)分化的信號通路。

大量研究表明骨髓間充質(zhì)干細胞在二維培養(yǎng)中分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞以及心肌細胞。這通常是通過使用細胞特異性分化培養(yǎng)基來實現(xiàn)的及通過翻譯和轉(zhuǎn)錄基因表達及胞外基質(zhì)的組成進行評定。

然而，骨髓間充質(zhì)干細胞在單層中的擴張會導(dǎo)致表型的改變，使紡錘形的骨髓間充質(zhì)干細胞在傳代過程中表現(xiàn)出一種寬而扁平的形態(tài)，進而反過來改變細胞的命運和分化潛能。特別是，與利用球?；蚯蝮w進行高密度細胞培養(yǎng)方法相比，2-D培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞軟骨分化效率較低。盡管骨髓間充質(zhì)干細胞在2-D培養(yǎng)中具有限制性，但骨髓間充質(zhì)干細胞被報道分化為多種細胞類型，不僅有中胚層細胞，而且有外胚層系細胞，包括視網(wǎng)膜前體細胞和感光細胞，神經(jīng)細胞，以及肝細胞樣細胞和胰島樣細胞等內(nèi)胚層細胞系。然而，在體外誘導(dǎo)分化往往不足以產(chǎn)生功能上有活性能力的細胞。例如，骨髓間充質(zhì)干細胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)前體樣細胞的瞬態(tài)分化被報道，這表明骨髓間充質(zhì)干細胞在擴大培養(yǎng)過程中可能被去分化。雖然骨髓間充質(zhì)干細胞是一種很有前途的細胞替代和免疫調(diào)節(jié)的來源，但要應(yīng)用于臨床仍有必要提高其分化方式。

由于二維培養(yǎng)技術(shù)的固有問題，人們試圖設(shè)計三維培養(yǎng)方法以更好地再現(xiàn)初始的微環(huán)境。因此，如圖1所述，我們探索了幾種方法在靜態(tài)和動態(tài)條件下，利用各種含有或不含生物材料的三維培養(yǎng)系統(tǒng)來維持、擴展和分化干細胞。 

3.1 靜態(tài)三維培養(yǎng)

3.1.1 球狀體 

最簡單的三維培養(yǎng)方法之一是形成多細胞聚集體或球體，在沒有補加物質(zhì)的情況下，細胞和胞外基質(zhì)之間進行三維相互作用。這些球體已被廣泛應(yīng)用于各種貼壁細胞類型，由強制或自發(fā)聚集技術(shù)形成，包括懸滴、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)中的低粘著培養(yǎng)板。球體由高度增殖、非增殖和凋亡細胞組成，氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)向球體中心的擴散有限，導(dǎo)致低氧環(huán)境的加劇。由于球體的異質(zhì)性，使得球狀體被更多地應(yīng)用于與同質(zhì)細胞增殖進行比較，研究其復(fù)雜的三維細胞結(jié)構(gòu)、細胞分化和腫瘤生物學(xué)。

代表性地，多能干細胞通過形成稱為胚狀體(EBS)的三維球體來誘導(dǎo)分化，這種胚狀體能夠自發(fā)分化為所有三個胚層。通過在培養(yǎng)基中添加細胞因子或生長因子，模仿胚胎發(fā)育和促進異質(zhì)分化從而誘導(dǎo)分化為各種特定的細胞類型。盡管如此，固有的異質(zhì)性使定向分化的再現(xiàn)性和胚狀體的高通量篩選技術(shù)復(fù)雜化。胚狀體的大小和數(shù)量已被發(fā)現(xiàn)影響分化效率，如在心肌細胞和造血分化。研究表明，分化也可以通過變化胚狀體的大小來控制。由于胚狀體是由多種微環(huán)境組成，對氧和其他可溶性因子的利用率不同，細胞在胚狀體中的位置可以差異性地調(diào)節(jié)細胞命運。此外，大的胚狀體傾向于分化為內(nèi)胚層和中胚層細胞類型，而較小的胚狀體傾向于分化為外胚層。 

與二維培養(yǎng)條件相比，三維球體培養(yǎng)從表型分析、肝細胞基因和蛋白質(zhì)的表達以及細胞排泄膽汁代謝產(chǎn)物能力等方面提高了胚胎干細胞的肝細胞分化能力。胚胎干細胞的三維球體培養(yǎng)在內(nèi)皮細胞管形成、功能膽管分化，肝祖細胞的植入潛能及造血分化中旁分泌信號發(fā)出等方面也有改善。總之，三維球體培養(yǎng)產(chǎn)生了胚胎干細胞的功能衍生物。然而，球體的長期懸浮培養(yǎng)常常導(dǎo)致細胞的聚集，由于在聚集體中營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的向里擴散和廢物的向外擴散受到限制而導(dǎo)致壞死中心。

與胚胎干細胞相比，短期球體培養(yǎng)已被用于間充質(zhì)干細胞的維持和擴大。當傳代培養(yǎng)回到2-D培養(yǎng)條件時，球體培養(yǎng)生長的骨髓間充質(zhì)干細胞呈現(xiàn)未分化形態(tài)，與貼壁培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞相比，胞外基質(zhì)沉積提高，分化潛能增強。骨髓間充質(zhì)干細胞在三維球體培養(yǎng)時克隆生長和多能性增強，并且miRNA表達提高，多能基因，OCT 4，SOX 2和NANOG啟動子區(qū)的乙?；饔迷鰪?。

此外，短期培養(yǎng)3天的間充質(zhì)干細胞球體表現(xiàn)出更高的抗癌因子和抗炎因子的表達，分別包括IL-24、TNFα相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體，CD 82和TNFα刺激基因/蛋白6(TSG-6)和斯鈣素-1。這些研究表明，三維球體培養(yǎng)可改善間充質(zhì)干細胞的治療性能。另一研究表明，球體培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞對豬模型移植后的保留、存活和整合均有改善作用。然而，長期球體培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞已經(jīng)被證明能有效地誘導(dǎo)分化。 

與單層培養(yǎng)相比，在三維球體中生長的骨髓間充質(zhì)干細胞顯示出更高的軟骨分化，以及在體外和體內(nèi)的成骨分化，并且大鼠顱骨缺損骨再生增強。

利用這些方法進行大規(guī)模的干細胞擴大是很困難的，因為無法控制聚集體的大小，從而導(dǎo)致球體的聚集、球體壞死/凋亡，以及細胞增殖的抑制。這需要通過攪拌或摻入生物材料來盡量減少球體團聚，這將在3.2.1和3.2.2節(jié)中討論。 

3.1.2 生物材料

天然和合成的生物相容性材料和生物降解材料可以提供各種生物信號和不同程度的機械強度。在體外培養(yǎng)時，生物材料已越來越多地被整合在一起以模擬干細胞生態(tài)位的生物化學(xué)和生物物理特性，從而幫助引導(dǎo)細胞自我更新或分化為特定的細胞系。天然生物材料的引入可能導(dǎo)致不同水平的誘導(dǎo)信號，細胞附著和支架完整性。天然生物材料，包括瓊脂糖，纖維連接蛋白，1型膠原蛋白(Col1)，透明質(zhì)酸(HA)，殼聚糖和海藻酸鈉，也可以被功能化，但在體外更難控制，因為它們經(jīng)常將生物信號傳遞給細胞。因此，生物材料可以幫助細胞維持與分化。然而，諸如批次間的差異性以及異種培養(yǎng)基成分引起疾病的可能性等問題限制了它們的使用。合成聚合物，如聚乙二醇(PEG)、聚-l-賴氨酸(PLL)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)和聚-dl-乳酸-乙醇酸(PGLA)，隨著交聯(lián)基團的加入常被最終功能化。聚乙二醇聚合物可能是最常研究的，因為它們無毒，易被功能化，并且表現(xiàn)低蛋白質(zhì)吸附，因此它們應(yīng)用于人類生物醫(yī)學(xué)是安全的。

天然生物材料和合成聚合物正越來越多地被用作三維支架材料以維持、擴增和分化干細胞。具有可調(diào)力學(xué)性能的支架允許調(diào)控細胞活力、增殖和分化。限制在聚集體中心的細胞對氧和營養(yǎng)物質(zhì)的可用性將導(dǎo)致休眠，并最終導(dǎo)致壞死/凋亡，通過這種方式，這種支架結(jié)構(gòu)能夠減緩對懸浮培養(yǎng)中干細胞的存活和生長有消極影響的細胞聚集現(xiàn)象。加入可溶性因子，如細胞因子或生長因子，或通過用于固著依賴性增殖的粘附配體進一步功能化，支架為用于干細胞自我更新和分化的胞外基質(zhì)生產(chǎn)提供了構(gòu)架。這些材料通過靜電紡絲、溶劑澆鑄、氣體發(fā)泡、三維打印和自組裝等多種技術(shù)形成了具有明顯不同孔徑、彈性、附著力和抗拉強度的支架。

兩種類型的支架通常用于干細胞的三維培養(yǎng)。首先，預(yù)制或剛性支架需要細胞播種，或細胞遷移到支架。由于基底剛度、機械信號和生物材料信號對干細胞的分化非常重要，因此這些支架常用于分化步驟中。第二類支架在支架形成時自組裝包裹細胞。生物材料的自組裝通常通過各種交聯(lián)方法來促進達成。物理交聯(lián)支架通常被稱為可逆凝膠和可通過pH或溫度的可逆變化形成，獲得機械力弱的支架。而通過化學(xué)交聯(lián)形成的支架則會產(chǎn)生共價鍵，傾向于形成機械力堅固的支架。由親水生物材料制成的水凝膠支架模仿天然軟組織完全水合化的胞外基質(zhì)，所以通常被用于干細胞的培養(yǎng)。 

水凝膠的組分也可以用藥物、細胞因子和生長因子進行修飾，以支持細胞在體外的生長和分化以及細胞在體內(nèi)的整合。水凝膠支架的尺寸限制了三維培養(yǎng)的規(guī)模由于在靜置培養(yǎng)中營養(yǎng)物質(zhì)的擴散問題。

一般來說，在三維水凝膠支架中維持胚胎干細胞需要通過支架降解來進行類似于二維培養(yǎng)的常規(guī)傳代。人多能干細胞在溫敏性水凝膠中的培養(yǎng)，每隔5天傳代一次，至50代以上，約95%的細胞群體保持多能性。同樣地，誘導(dǎo)多能干細胞在高孔電紡聚苯乙烯三維支架上呈現(xiàn)聚集體生長，在無異種條件下無數(shù)代的細胞保持了多能性和分化潛能。然而，理想的三維培養(yǎng)系統(tǒng)應(yīng)該在減少常規(guī)傳代需要的同時支持多能干細胞擴大，因此也限制了細胞的操作。

透明質(zhì)酸底物常被用于支持多能干細胞的生長，因為透明質(zhì)酸出現(xiàn)于胚胎發(fā)生過程中且在未分化細胞中高表達。另外，采用不同硬度的改性透明質(zhì)酸水凝膠研究了三維培養(yǎng)條件下機械強度對胚胎干細胞的影響；通過模擬著床前囊胚內(nèi)細胞團的微環(huán)境，胚胎干細胞在較軟的水凝膠上生長最好的支持了胚胎干細胞在無飼養(yǎng)層和在小鼠胚胎成纖維細胞條件培養(yǎng)液中的增殖和多能性。在光聚合透明質(zhì)酸凝膠中延長三維培養(yǎng)20天0傳代的人胚胎干細胞保持了多能性和自我更新潛力，這表明3-D水凝膠提供了一個支持胚胎干細胞緊湊克隆生長的仿生微環(huán)境。 

我們最近報道了用巰基功能化右旋糖酐(Dex-SH)和四丙烯酸酯功能化的聚乙二醇(PEG-4-acr)自組裝的三維水凝膠對小鼠胚胎干細胞進行0傳代維持培養(yǎng)達到超過6周以上。圖2A描述了同時包封胚胎干細胞的自組裝支架的形成原理，并在圖2C-E對包封細胞的克隆生長進行了描述。有趣的是，胚胎干細胞的生長是獨立固著的，因為支架缺乏粘附配體。此外，在培養(yǎng)的相當長一段時間內(nèi)，生長在三維水凝膠中的胚胎干細胞內(nèi)的三個多能性標記物OCT 4、NANOG和KLF 4的表達增強。在一些研究中也有類似的觀測結(jié)果表明，維數(shù)和誘導(dǎo)生物材料信號都能影響胚胎干細胞的自我更新機制。例如，在用PGLA，膠原蛋白和殼聚糖制備的三種不同支架中培養(yǎng)的胚胎干細胞中，觀察到了干性基因的差異調(diào)控，可上調(diào)OCT 4的表達，下調(diào)SOX 2的表達；而NANOG僅在殼聚糖支架中高度上調(diào)。綜上，可以推測支架微環(huán)境在影響細胞-基質(zhì)通訊中起著重要作用。三維培養(yǎng)的胚胎干細胞中多能性基因的上調(diào)機制值得未來繼續(xù)研究下去。雖然在水凝膠支架中進行胚胎干細胞的三維培養(yǎng)有很大的發(fā)展前景，但進一步優(yōu)化加入粘附配體和生長因子，可能有助于人胚胎干細胞的增殖。 

通過在體外模擬生化和機械信號，應(yīng)用三維支架分化胚胎干細胞衍生物可改善以下過程：軟骨形成，成骨生成，造血作用，神經(jīng)形成，心肌細胞分化和肝細胞增殖。例如，Col1支架與纖維連接蛋白聯(lián)合誘導(dǎo)形成血管和內(nèi)皮分化，而加入層粘連蛋白則導(dǎo)致心肌細胞分化。 

在合成自組裝肽支架和納米纖維支架中的三維培養(yǎng)促進胚胎干細胞向成骨樣細胞的分化。而添加明膠的納米纖維PCL支架支持誘導(dǎo)多能干細胞的軟骨分化[156]。與N-鈣粘蛋白衍生肽(His-Ala-Val-Asp-Lle)結(jié)合的聚乙二醇水凝膠誘導(dǎo)小鼠胚胎干細胞的神經(jīng)分化。經(jīng)adhesive cue、RGD(Arg-Gly-Asp)序列修飾的藻酸鹽支架支持胚胎干細胞和視網(wǎng)膜組織衍生物的視網(wǎng)膜分化。

為了研究力學(xué)性能對細胞分化的影響，我們將胚胎干細胞植入預(yù)制的聚二甲基硅氧烷(PDMS)支架上，支架的高彈性使其能夠?qū)C械信號傳遞給細胞。同樣地，PDMS支架可以用于研究基體彈性的影響以及壓縮或拉伸力的應(yīng)用(圖3)。在三維PDMS支架材料中進行小鼠胚胎干細胞的三維培養(yǎng)，由于PDMS基質(zhì)的彈性和壓力的傳導(dǎo)，導(dǎo)致了選擇性軟骨分化。PDMS生長的胚胎干細胞多能性標記基因表達水平下降，同時軟骨祖細胞基因標記增加。我們評估了PDMS支架培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞7天后施加24小時壓力(0.05MPa)的影響。在PDMS中生長的胚胎干細胞在壓力下表現(xiàn)出分化成成纖維樣形態(tài)(圖3C-E)。因此，仿生支架有助于研究用于組織工程和移植應(yīng)用的胚胎干細胞衍生物的分化和生成過程。間充質(zhì)干細胞成纖維樣細胞形態(tài)與肌動蛋白細胞骨架的組織結(jié)構(gòu)和粘著斑的分布密切相關(guān)。 

盡管骨髓間充質(zhì)干細胞的特征之一是在二維培養(yǎng)條件下貼壁生長，但對于在三維培養(yǎng)中附著的必要性存在著相互矛盾的報導(dǎo)。當支架與分別從纖維連接蛋白和層粘連蛋白衍生而來的粘著配體，RGDSP(Arg-gly-Asp-Ser-Pro)，和與IKVAV(Ile-Lys-Val-Ala-Val)序列在較小程度上結(jié)合時，光封裝在非降解聚乙二醇水凝膠中的間充質(zhì)干細胞表現(xiàn)出有所提高的存活率，這與在2-D粘附培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞中的發(fā)現(xiàn)相似。應(yīng)用補充有和未補充RGD序列的三維透明質(zhì)酸水凝膠，研究了水凝膠支架中的間充質(zhì)干細胞的擴散和增殖作用。骨髓間充質(zhì)干細胞在兩種水凝膠中均有增殖，但僅在RGD序列修飾的支架中觀察到細胞的擴散。增殖受到基質(zhì)硬度、交聯(lián)密度、RGD濃度和隨濃度的變化的支架降解速率的限制。然而，研究結(jié)果表明，即使沒有細胞粘附配體，水凝膠降解顯著提高了骨髓間充質(zhì)干細胞的存活率。

同樣，我們觀察到在Dex-SH/PEG-4-ACR自組裝支架中的臍帶來源的骨髓間充質(zhì)干細胞(圖4A)沒有顯示明顯的增殖或骨髓間充質(zhì)干細胞成纖維樣形態(tài)(圖4B-C)。用1型骨膠原蛋白纖維制備了dex-SH/PEG-4-acr自組裝支架，粘附的Cy3標記的骨髓間充質(zhì)干細胞顯示成纖維樣細胞形態(tài)，共聚焦顯微鏡下觀察到了細胞增殖(圖4D-E)。

骨髓間充質(zhì)干細胞的三維培養(yǎng)可以提高體內(nèi)移植的適應(yīng)性，促進體內(nèi)免疫抑制的吲哚胺2，3-雙加氧酶、IL-6、M-CSF、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β、HGF和PGE 2因子的分泌。

據(jù)報道，培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞能改善細胞植入的預(yù)后。例如，在三維骨膠原-支鏈淀粉水凝膠中生長的骨髓間充質(zhì)干細胞可誘導(dǎo)分泌血管生成細胞因子，血管內(nèi)皮生長因子-a(Vegf-a)和單核細胞趨化蛋白-1(Mcp-1)。水凝膠培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞移植物分化為成纖維細胞和內(nèi)皮細胞，從而促進創(chuàng)面愈合和新生血管生成。封裝在3-D 透明質(zhì)酸水凝膠的骨髓間充質(zhì)干細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)后，CD 16和HLA-DR更低，CD 206表達增加，這顯示其可能更適合用于移植。有趣的是，與在2-D培養(yǎng)條件下生長的間充質(zhì)干細胞相比，三維維骨膠原-支鏈淀粉水凝膠中生長的骨髓間充質(zhì)干細胞具有增強的自我更新能力和多能基因，OCT 4、SOX 2和KLF 4的表達。

模擬體內(nèi)微環(huán)境的三維培養(yǎng)條件也被研究以分化間充質(zhì)干細胞。支架的機械剛度和載荷性能促進了骨髓間充質(zhì)干細胞分化為不同的特定細胞系。例如，較軟的基質(zhì)誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)和β胰島細胞，以及分化為軟骨細胞和脂肪細胞，然而，增加基質(zhì)剛度則支持間充質(zhì)干細胞分化為成肌細胞和成骨細胞。更堅硬的基質(zhì)也能增強整合素結(jié)合和誘導(dǎo)成骨分化。模擬接合作用的壓縮力通過動力傳導(dǎo)支架增加間充質(zhì)干細胞中軟骨生成基因的表達，誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化。 

含有膠原蛋白的支架作為結(jié)締組織細胞外基質(zhì)的主要成分，已被用于分化間充質(zhì)干細胞為中胚層細胞系，包括成骨細胞，軟骨細胞和心肌細胞。骨髓間充質(zhì)干細胞在模擬軟骨細胞外基質(zhì)的透明質(zhì)酸組成的三維支架中培養(yǎng)分化為軟骨細胞系。 

骨髓間充質(zhì)干細胞在機械性強的多糖-殼聚糖組成的三維支架中培養(yǎng)，促進其成骨分化。相反，臍帶來源的間充質(zhì)干細胞在軟的3-D藻酸鹽支架中分化為神經(jīng)元。因此，對于誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化為特定細胞系來說，優(yōu)化三維支架的組成和力學(xué)性能是非常重要的。

總之，通過利用機械信號、可溶性因子的空間梯度、細胞-細胞和細胞與胞外基質(zhì)間的交互作用，現(xiàn)有的培養(yǎng)技術(shù)可提高維持和擴大間充質(zhì)干細胞的三維培養(yǎng)。這些研究可以揭示基本的細胞生物學(xué)過程和機制。在靜態(tài)培養(yǎng)中使用單個支架進行大規(guī)模細胞擴大仍是一個挑戰(zhàn)。如果支架的大小增加，由于支架中的氧、營養(yǎng)物和廢物的進出擴散，支架中心的細胞生長可能受到限制。往動態(tài)培養(yǎng)體系包括攪拌和流注灌注系統(tǒng)中補料的方法，目前正被用于控制培養(yǎng)條件，使體外生長更加均勻。

3.2 動態(tài)三維培養(yǎng)

治療、制藥和生物技術(shù)應(yīng)用都需要大量的同質(zhì)高質(zhì)量細胞，傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)技術(shù)是不可行的。動態(tài)生物反應(yīng)器有助于在高密度下培養(yǎng)細胞，使細胞生長可重復(fù)，并使在二維培養(yǎng)細胞擴大時最小化其可見的可變性。生物反應(yīng)器中細胞的大規(guī)模擴大需要有明確的、規(guī)范化的培養(yǎng)條件，包括pH值、溫度、溶解氧濃度以及代謝產(chǎn)物和廢物的去除。在靜態(tài)培養(yǎng)中，當細胞在高濃度下接種、還原氧和營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)移和大細胞聚集增加細胞死亡時，會發(fā)生細胞聚集。 

生物反應(yīng)器有多種設(shè)計，從單個細胞的擴大或分化到整個組織的培養(yǎng)均可廣泛應(yīng)用。由于成本低，使用方便，旋轉(zhuǎn)瓶是最常見的，通過內(nèi)部葉輪允許改變攪拌速度連續(xù)攪拌懸浮細胞。這種方法導(dǎo)致水動力剪切力，使細胞與氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)混合，獲得一個更均勻的環(huán)境，然而，過度的攪拌導(dǎo)致細胞死亡。因此，旋轉(zhuǎn)壁容器被設(shè)計為通過水平旋轉(zhuǎn)來限制剪切力，允許在沒有內(nèi)部攪拌機制的情況下進行培養(yǎng)混合。培養(yǎng)參數(shù)可以通過流量灌注系統(tǒng)來控制，使營養(yǎng)物和廢物持續(xù)交換，與分批式生物反應(yīng)器系統(tǒng)對比，由于時間推移，代謝物和廢物積累，后者在規(guī)模上和培養(yǎng)時間長度上都受到限制。因此，必須定期更換培養(yǎng)基，以限制廢物堆積的抑制作用，或者就必須在多個生物反應(yīng)器中接種細胞以實現(xiàn)大規(guī)模的細胞擴大。最后，模擬組織生理學(xué)，利用壓縮力和拉伸力的機械力生物反應(yīng)器已經(jīng)被開發(fā)出來，并且越來越多地用于接合組織為細胞分化進行工程構(gòu)建。這些技術(shù)可以通過使用生物材料(即微載體和微膠囊)來進一步改良，如下文所述的，這些生物材料可用于高濃度懸浮培養(yǎng)的細胞的生長?？偟膩碚f，細胞的生長和命運取決于培養(yǎng)條件，包括細胞接種密度、培養(yǎng)基成分和生物材料的摻入。

3.2.1 微載體

微載體，約100-300μm的小珠，由各種材料組成，包括聚苯乙烯、明膠、葡聚糖和膠原蛋白，合成后具有多樣的多孔性和形貌。懸浮培養(yǎng)中，它們?yōu)楣讨蕾囆图毎峁┝苏掣奖砻妗＜毎谖⑤d體上的粘附可以優(yōu)化，以促進細胞的擴增或分化。微載體還限制了細胞的聚集，并為細胞生長到高密度提供了大量的表面面積，從而可以通過酶解離收集濃縮的細胞。

旋轉(zhuǎn)瓶和微載體的動態(tài)培養(yǎng)技術(shù)已被證明支持人胚胎干細胞向高密度增殖。通過在微載體表面包被粘附蛋白已實現(xiàn)多能干細胞的附著。纖維素微載體包被一類胞外基質(zhì)蛋白-人工基底膜，被用于人類胚胎干細胞長期擴大和維持。纖維素微載體包被胞外基質(zhì)蛋白，如玻連蛋白，層粘連蛋白或PLL，已被證明能促進干細胞的多能生長。事實上，在無異種無動物來源材料的條件下，在連續(xù)灌注生物反應(yīng)器系統(tǒng)中觀察到附著在微載體上的人類胚胎干細胞的生長速度增加了12倍。

利用微載體進行三維培養(yǎng)的其中一個主要優(yōu)點是可以利用分化培養(yǎng)基進行擴增和隨后分化為特定的細胞系。利用微載體對人類胚胎干細胞進行更高質(zhì)量的擴大，體現(xiàn)在其形成胚狀體的效率比在二維培養(yǎng)條件下生長的細胞高10倍。微載體也被發(fā)現(xiàn)支持分化胚狀體為血液血管母細胞，血液血管母細胞可分化為造血細胞和內(nèi)皮細胞。胚胎干細胞向心肌細胞的擴大和分化都是通過使用微載體旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)技術(shù)實現(xiàn)的。 

胚胎干細胞衍生的心肌細胞表達細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子、離子通道基因和肌動蛋白。同樣地，使用膠原蛋白涂層的微載體，胚胎干細胞首次擴大到45倍，然后利用分化培養(yǎng)基將其分化為內(nèi)胚層細胞系，特別是胰島細胞和肝細胞。然而，還不確定使用微載體分化胚胎干細胞是否是可行的。在其中一項研究中，用攪拌式生物反應(yīng)器中的微載體培養(yǎng)胚胎干細胞，其衍生的肝細胞分泌的蛋白質(zhì)水平低于原代肝細胞。

在懸浮培養(yǎng)中，微載體也被研究以放大間充質(zhì)干細胞的增殖。骨髓和胎盤來源的骨髓間充質(zhì)干細胞已使用微載體在動態(tài)生物反應(yīng)器中培養(yǎng)放大。然而，與在靜態(tài)培養(yǎng)瓶中的擴大相比，細胞活力和增殖能力更低。在動態(tài)生物反應(yīng)器中生長并在微載體3-膠原包被葡聚糖基微載體上擴大時，來源于不同骨髓供體的骨髓間充質(zhì)干細胞表現(xiàn)出不同的增殖率，在二維培養(yǎng)中表現(xiàn)出類似的生長特性。開展了相似的研究，檢測了不同的微載體，觀察到了來源于不同骨髓樣品的間充質(zhì)干細胞在SoloHill塑料珠上培養(yǎng)時的可再生生長，這意味著生物材料信號在間充質(zhì)干細胞的增殖中起著重要作用。因此，確定合適的微載體對間充質(zhì)干細胞的擴大具有重要意義。此外，各種培養(yǎng)參數(shù)，包括氧濃度、攪拌速率和養(yǎng)分交換是實現(xiàn)間充質(zhì)干細胞的更高增殖的重要考慮因素。

人們對利用微載體分化骨髓間充質(zhì)干細胞表現(xiàn)出相當大的興趣[195，208-210]。數(shù)個報導(dǎo)表明微載體有助于間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞系[195]和軟骨細胞系[208，209]。事實上，可生物降解的聚已酸內(nèi)酯微載體支持胎兒的間充質(zhì)干細胞在體外向成骨細胞分化，與二維培養(yǎng)的細胞相比，在移植時表達更高水平的成骨基因和鈣沉積和等效的骨形成。同時釋放轉(zhuǎn)化生長因子β3的微載體表現(xiàn)出可提高骨髓間充質(zhì)干細胞的軟骨分化。在另一項研究中，在微載體上接種的間充質(zhì)干細胞移植到小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型后，表現(xiàn)出更高的軟骨再生。盡管利用微載體在生長和分化骨髓間充質(zhì)干細胞方面取得了一些成功，對已分化的細胞的功能狀態(tài)仍應(yīng)進一步地進行研究。

3.2.2微型膠囊

與主要有助于細胞附著到珠子表面的微載體相反，微囊化是將細胞固定在半滲透性材料或膜內(nèi)的過程，允許細胞生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和生長因子進行自由擴散。球形囊內(nèi)細胞微膠囊化過程不僅可用于對抗懸浮培養(yǎng)中的團聚和剪切力，同時也能防止移植后的免疫反應(yīng)。依據(jù)所用生物材料的組成和生長因子的摻入，微膠囊微環(huán)境可以被調(diào)控以保持干性或誘導(dǎo)干細胞分化。通常在乳化或擠壓過程細胞被膠囊化，在細胞周圍形成保護性膠囊，并允許細胞在囊內(nèi)生長。海藻酸和瓊脂糖是兩種最常用的生物分子，分別通過光交聯(lián)和溫度依賴凝膠化進行包封細胞。軟性海藻酸膠囊通常用機械性強的聚合陽離子(即殼聚糖、聚乙二醇、PLL)涂層來提高膠囊的完整性。此外，由于瓊脂糖膠囊缺乏粘附性能，它們可以通過加入其他生物材料來改良，如膠原蛋白或明膠，以促進細胞的附著和生長。

維持細胞種群的活性和多能性以及同質(zhì)性，是大規(guī)模擴大胚胎干細胞的必要條件。防止細胞聚集和改善條件使得允許營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和生長因子擴散是非常重要的。瓊脂糖中的微膠囊可防止細胞聚集，并且使胚胎干細胞生長更快，而不發(fā)生壞死。一般來說，多能干細胞的包被已被證明能保護細胞免受化學(xué)和機械力，包括水力的剪切力，這種剪切力對懸浮培養(yǎng)中的細胞活性有負面影響。包裹在海藻酸鈣水凝膠微膠囊中的胚胎干細胞在無異種條件下生長能延長培養(yǎng)期，而且不影響細胞活性和多能性。

包裹在藻酸鹽珠子中的胚胎干細胞分化成能夠產(chǎn)生胰島素的β細胞。此外，胚胎干細胞也被分化為能夠分泌白蛋白和尿素的肝細胞，這提示微膠囊有助于胚胎干細胞分化為功能性內(nèi)胚層衍生物。同樣，微膠囊化也促進了胚胎干細胞的中胚層分化。在PLL包被的海藻酸鈉膠囊中生長的胚胎干細胞分化為高水平表達Nkx2.5和GATA 4的心肌細胞。然而，被包裹在用RGD序列修飾的PEGDA微膠囊中和HA水凝膠微囊中的胚胎干細胞支持被分化為軟骨細胞。在磷酸鈣骨水泥微囊中培養(yǎng)可促進胚胎干細胞的成骨分化，促進骨再生。藻酸鹽三維培養(yǎng)可促進胚胎干細胞向外胚層分化，和經(jīng)透明質(zhì)酸修飾的海藻酸鈉可提高胚胎干細胞向表達突觸標志的神經(jīng)細胞分化?？傊?，三維微膠囊培養(yǎng)擴大和分化胚胎干細胞被證明可能是組織工程應(yīng)用中不可或缺的。 

微膠囊化的骨髓間充質(zhì)干細胞常用于免疫調(diào)節(jié)，移植后導(dǎo)致纖維化減少，炎癥減少。因為骨髓間充質(zhì)干細胞的擴大更依賴于固著，用粘著配體和或胞外基質(zhì)組分對微膠囊進行改性可以促進細胞的擴增和分化。與靜態(tài)培養(yǎng)相比，動態(tài)培養(yǎng)提高了藻酸鹽微膠囊包裹的間充質(zhì)干細胞的增殖。然而，間充質(zhì)干細胞包裹在加有粘附配體的海藻酸鈉中仍能存活，但沒有增殖，這表明單獨附著對細胞生長而言是不夠的。當海藻酸鈉包裹的間充質(zhì)干細胞被施加壓力而非剪切力時，它們分化為軟骨祖細胞。間充質(zhì)干細胞包裹在用RGD序列修飾的藻酸鹽微膠囊中可持續(xù)釋放轉(zhuǎn)化生長因子β1，誘導(dǎo)其分化，增加軟骨生成基因表達和體外基質(zhì)沉積，促進體內(nèi)軟骨再生。用鈣改性海藻酸鈉微囊三維培養(yǎng)時，間充質(zhì)干細胞優(yōu)先分化為軟骨細胞系，也可觀察到胞外基質(zhì)的生產(chǎn)增強。通過礦化海藻酸鈉和PLL包被的海藻酸鈉，以及膠原蛋白和瓊脂糖改性膠原蛋白和殼聚糖微膠囊處理，微膠囊技術(shù)還被用于促進間充質(zhì)干細胞在動態(tài)三維培養(yǎng)中的成骨分化。除分化外，為體內(nèi)修復(fù)退行性組織的同時盡量減少免疫反應(yīng)，微囊化間充質(zhì)干細胞可能被證明是間充質(zhì)干細胞衍生物的一種有利的細胞傳遞方法。

與微載體和微膠囊結(jié)合使用的動態(tài)生物反應(yīng)器具有提高細胞的質(zhì)量和數(shù)量的潛力。但是，許多挑戰(zhàn)依然存在，包括細胞聚集后的分化潛力，基因表達改變，流體動力剪切力的產(chǎn)生和培養(yǎng)的可變性。 

因此，需要進一步的研究，將動態(tài)生物反應(yīng)器與生物和工程組分結(jié)合用于獲得干細胞最優(yōu)的擴大和分化。 

3.2.3 微流體

無論在體積還是尺寸上都是小規(guī)模系統(tǒng)的微流體越來越多地被研究用于培養(yǎng)細胞。它們可以通過灌注培養(yǎng)基交換和可溶性因子的化學(xué)梯度來模擬活體微環(huán)境來進行單細胞分析。他們被用來研究細胞分泌信號和微環(huán)境對干細胞命運的影響。這些進展導(dǎo)致了整個器官系統(tǒng)設(shè)備的發(fā)展，如模仿人體的微環(huán)境的“器官芯片”。

微流體可以控制可溶的微環(huán)境，而微環(huán)境又可以調(diào)節(jié)細胞間的自分泌/旁分泌信號，以及水動力流速引起的剪切力。在微流體中灌注培養(yǎng)4天，小鼠胚胎干細胞在更高的流速時增殖，但在最慢流速下不增殖。在無飼養(yǎng)層的微流體室中培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞形成集落，并表現(xiàn)出增高的 LIF表達，幾乎是高于在宏觀培養(yǎng)條件下分泌的140倍，提示內(nèi)源性信號可能在決定干細胞的命運中起著重要的作用。 當LIF分泌受到抑制時，胚胎干細胞優(yōu)先分化為中胚層細胞系。通過改變培養(yǎng)條件、流速和增強外源的生長因子，微流體培養(yǎng)系統(tǒng)也可用于誘導(dǎo)胚胎干細胞的分化。緩慢流動的微流體支持小鼠胚胎干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞和雪旺細胞樣細胞。

此外，不連續(xù)灌注培養(yǎng)中流速的變化允許胚胎干細胞直接分化為心肌細胞和肝細胞，這些細胞在微流控培養(yǎng)系統(tǒng)中表現(xiàn)出功能表型和對藥物治療的反應(yīng)。

與多能干細胞相似，微流控培養(yǎng)系統(tǒng)可用于骨髓間充質(zhì)干細胞的小規(guī)模增殖和受控分化。采用微流體微團培養(yǎng)法連續(xù)灌流培養(yǎng)，骨髓間充質(zhì)干細胞增殖34倍。隨后，誘導(dǎo)生長因子的加入導(dǎo)致了骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)向同質(zhì)軟骨分化。恒定微流體灌注培養(yǎng)使骨髓間充質(zhì)干細胞向肝細胞樣細胞分化，這種細胞表達細胞特異性基因并能夠攝取低密度脂蛋白，暗示功能性細胞。微流控裝置中極低流體剪切力的應(yīng)用誘導(dǎo)了間充質(zhì)干細胞的細胞遷移和成骨分化。通過微流控裝置中的動態(tài)拉伸和周向應(yīng)變模擬活體血管力學(xué)生物學(xué)，導(dǎo)致間充質(zhì)干細胞分化為血管樣細胞。經(jīng)過IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤) 和流體剪切力處理的骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞分化增加了3倍。微流控培養(yǎng)技術(shù)尚處于起步階段，但有望用于闡明生物過程、組織工程學(xué)和制藥應(yīng)用。

總之，多種三維培養(yǎng)技術(shù)對干細胞的增殖和分化均表現(xiàn)出增強作用。如圖5總結(jié)的期望的應(yīng)用，每個三維培養(yǎng)系統(tǒng)都有各自的優(yōu)缺點。一般來說，這些技術(shù)在復(fù)雜性和可控性上都存在差異。例如，球體的形成是一種非常簡單的技術(shù)，在沒有生物材料加入的情況下，可使細胞與胞外基質(zhì)進行三維的相互作用。然而，球體培養(yǎng)會導(dǎo)致細胞群體和微環(huán)境的異質(zhì)性，包括壞死/缺氧核的形成。

生物材料的加入可通過模擬體內(nèi)胞外基質(zhì)誘導(dǎo)生物化學(xué)和機械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來提高細胞的生長和分化。要確定三維支架的合適的生物材料和力學(xué)性能則必須針對每種細胞類型和應(yīng)用進行優(yōu)化。此外，由于批間差異，生物材料來源的支架可能導(dǎo)致重復(fù)性差。 生物反應(yīng)器支持干細胞的大規(guī)模生長和/或分化。靜態(tài)生物反應(yīng)器受到在沒有生物材料(微載體或微膠囊)的情況下細胞聚集和受到批量更換培養(yǎng)基的限制。相反，通過攪拌和培養(yǎng)基灌注分散復(fù)雜的均質(zhì)培養(yǎng)基和細胞，可使得動態(tài)生物反應(yīng)器高度可控。然而，這些方法成本高昂，而且細胞還受到引入可被使用生物材料而限制的水動力應(yīng)力的影響。在大規(guī)模培養(yǎng)過程中，需要進行額外的優(yōu)化，以確定理想的培養(yǎng)參數(shù)和細胞分析手段。

自從人類胚胎干細胞分離以來，在利用選擇性培養(yǎng)基了解其自我更新、多能性和分化機制方面取得了重大進展。同樣的，間充質(zhì)干細胞從不同的組織中分離、培養(yǎng)并分化為中胚層系。此外，用于臨床目的，新的無異質(zhì)培養(yǎng)基已被開發(fā)用以培養(yǎng)干細胞。 然而，在造血干細胞和祖細胞等其他干細胞的繁殖方面的進展仍然很少。即使是胚胎干細胞和間充質(zhì)干細胞的擴大和分化也面臨著許多挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)包括： 

4.1 培養(yǎng)的細胞的不均一性

2-D培養(yǎng)技術(shù)固有的低效性、勞動密集性和昂貴性，對干細胞的擴大有一定的限制。此外，2-D培養(yǎng)產(chǎn)生了各種各樣的干細胞和衍生物。胚胎干細胞和間充質(zhì)干細胞在2-D培養(yǎng)條件下有非特異性分化的傾向。即使干細胞定向分化成特定的細胞系，通常也只是部分地完成，而且分化的衍生物缺乏功能性。此外，在二維培養(yǎng)條件下擴張的細胞的生存、整合和功能受到限制?？偟膩碚f，二維培養(yǎng)的規(guī)模擴大是很困難的，在2-D培養(yǎng)條件下常常不能成功模擬體內(nèi)微環(huán)境以進行干細胞的維持和分化。

4.2 克隆生長

克隆生長與干細胞的自我更新有關(guān)。干細胞克隆生長的下降表明干細胞的自我更新能力降低且干細胞的擴大受到限制，對于成體干細胞如間充質(zhì)干細胞來說尤其明顯。已經(jīng)證明，傳代降低了間充質(zhì)干細胞的克隆性生長，增殖能力和自我更新潛力。單細胞分離后，人胚胎干細胞生存不良，喪失克隆原性，限制了增殖潛能。單細胞的同步克隆生長對于獲得同質(zhì)細胞群體是很重要的。因此，骨髓間充質(zhì)干細胞和多能干細胞培養(yǎng)方面的改進對于這些細胞的大規(guī)模和長期擴大來說是必不可少的。

4.3生物材料

通過加入生物材料以模擬天然3-D微環(huán)境的生物化學(xué)和生物物理特性通常能促進三維培養(yǎng)。多種天然和合成生物材料被用來開發(fā)合適的支架來模擬細胞在體內(nèi)生長的條件。

然而，通常很難確定哪種生物材料對于特定類型的干細胞的生長和分化是最適合的。例如，在培養(yǎng)中使用不同的生物材料引起的變異性和下降的可重復(fù)性。生物材料也已知在可能影響干細胞的維持和分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用。因此，需要進一步的研究以找到能提高培養(yǎng)細胞的質(zhì)量和數(shù)量的合適的生物材料。

4.4培養(yǎng)條件優(yōu)化

盡管有關(guān)干細胞生長和分化的文獻數(shù)量迅速增加，但缺乏標準的細胞培養(yǎng)方法。2-D培養(yǎng)方法操作簡便，常見，但效率不高。我們需要努力開發(fā)三維培養(yǎng)系統(tǒng)，這一系統(tǒng)雖然效率更高，但涉及到許多參數(shù)，包括培養(yǎng)基組成、生物材料、機械力、氧含量、pH值和培養(yǎng)基灌注量，這些參數(shù)對培養(yǎng)細胞的質(zhì)量和數(shù)量均有影響。此外，細胞的聚集和養(yǎng)分/廢物交換的擴散對培養(yǎng)方法的標準化也是非常重要的。這會導(dǎo)致細胞群體的異質(zhì)性、壞死和細胞增殖的抑制。

最近在使用各種生物反應(yīng)器擴大或分化干細胞方面的進展令人鼓舞。與靜態(tài)生物反應(yīng)器相比，動態(tài)生物反應(yīng)器展現(xiàn)出更大的應(yīng)用前景。然而，動態(tài)生物反應(yīng)器采用攪拌或培養(yǎng)基灌注會引入流體動力學(xué)剪切力，對細胞活率產(chǎn)生不利影響。

4.5 機能活動

任何培養(yǎng)方法的其中一個主要考慮因素是培養(yǎng)的細胞應(yīng)具有最佳的活力，并具有與體內(nèi)細胞相當?shù)墓δ芑钚?。這些細胞也應(yīng)該能夠在體內(nèi)存活并整合到組織中。暴露于低氧應(yīng)激下的細胞在移植后表現(xiàn)出更容易存活。因此，細胞的再生應(yīng)該是一個重要的考慮因素，優(yōu)先于考慮用于臨床的目的。此外，開發(fā)從干細胞中獲得分化均勻的細胞的有效方法可能有助于產(chǎn)生可重復(fù)的結(jié)果，但具有挑戰(zhàn)性。未來的研究應(yīng)該集中在研究暫時性因素，利用適當?shù)纳锊牧蟻碓O(shè)計專門用于干細胞的生長和分化的微環(huán)境來仿真模擬體內(nèi)條件。

4.6 培養(yǎng)規(guī)?；?/span>

目前迫切需要為各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用生產(chǎn)大量高質(zhì)量的細胞。目前的細胞擴增方法生產(chǎn)了數(shù)百萬個細胞，而這些細胞是對個別病人有限的自體使用。即使是這樣，也可能沒有效果，因為最近的研究表明，更高濃度的移植細胞更有效。同種異體細胞治療的多中心臨床試驗需要數(shù)十億到數(shù)萬億的細胞。將細胞規(guī)模擴大到這一水平需要在培養(yǎng)基、培養(yǎng)設(shè)備和技術(shù)方面取得重大進展。細胞大規(guī)模培養(yǎng)的一個優(yōu)勢是在臨床試驗中可用于多種患者的細胞治療，并且其結(jié)果可以相互關(guān)聯(lián)。然而，大規(guī)模生產(chǎn)系統(tǒng)涉及到生物反應(yīng)器和GMP設(shè)施，需要生物醫(yī)學(xué)研究人員和工程師之間的合作。此外，一些技術(shù)的結(jié)合，包括用生長因子或配體修飾的生物材料以及其他生長參數(shù)以最優(yōu)地生長和分化干細胞成特定的細胞類型，對細胞治療、組織工程和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的進一步發(fā)展是必不可少的。

最近，在干細胞培養(yǎng)方面，特別是在使用生物材料和生物反應(yīng)器方面被報導(dǎo)取得了重大進展。這些三維培養(yǎng)方法不僅克服了二維培養(yǎng)相關(guān)的局限性，而且也有潛力擴大細胞到如臨床試驗，制藥或生物技術(shù)應(yīng)用需要的十億倍。用生物誘導(dǎo)、生物降解和生物相容性聚合物模擬在天然微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的胞外基質(zhì)、維度和空間梯度進行細胞三維培養(yǎng)，不僅有助于擴大和功能的改進，而且適合于干細胞的定向分化。需要生物反應(yīng)器和GMP設(shè)施的細胞大規(guī)模生產(chǎn)將受益于生物醫(yī)學(xué)研究人員和工程師之間的多學(xué)科合作。盡管面臨挑戰(zhàn)，三維培養(yǎng)系統(tǒng)的進步將為加速干細胞用于治療許多無法治愈的疾病的治療性應(yīng)用提供動力。 

圖2. 綠色熒光蛋白(GFP)標記的小鼠胚胎干細胞在自組裝支架上的三維生長。

(A)自組裝支架形成和封裝小鼠胚胎干細胞的示意圖 (B)自組裝支架的圖像，(C-E)分別代表熒光綠色標記胚胎干細胞在Dex-SH/PEG-4-Acr自組裝水凝膠中生長2,7和21天的復(fù)合共聚焦圖像。3-D培養(yǎng)的胚胎干細胞表現(xiàn)出無分化的克隆生長。標尺= 100 μm. 

圖3.GFP標記小鼠胚胎干細胞在預(yù)制PDMS支架中的三維生長。

(A)涉及機械力(壓縮力或張力)的預(yù)制PDMS支架中植入胚胎干細胞的示意圖  (B) PDMS支架的宏觀圖像，(C-E)分別代表綠色熒光標記的胚胎干細胞在預(yù)制PDMS支架中生長2天、7天和21天的共聚焦圖像。在第7天，將胚胎干細胞接種到支架上以0.05 MPa壓力壓縮24小時，然后繼續(xù)培養(yǎng)2周。壓縮PDMS支架可誘導(dǎo)胚胎干細胞分化為軟骨系，因其成纖維樣細胞形態(tài)。標尺= 100μm  

圖4.來源于人臍帶的Cy3標記的間充質(zhì)干細胞在三維自組裝支架中生長。

(A)二維培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞的光學(xué)顯微圖。(B-E)分別代表紅色熒光標記的間充質(zhì)干細胞在1型膠原蛋白 (Col1)缺失和存在的Dex-SH/PEG-4-Acr自組裝支架中生長1天 (B和D)和7 (C和E)天的共焦圖像。間充質(zhì)干細胞在添加Col1的三維支架中培養(yǎng)時表現(xiàn)為成纖維樣細胞形態(tài)。標尺= 100μm。