來源：科研小助手公眾號

在前兩期《質(zhì)粒構(gòu)建：從入門到精通之初窺門徑》、《質(zhì)粒構(gòu)建：從入門到精通之上下求索》（點(diǎn)標(biāo)題跳轉(zhuǎn)）中給大家介紹了質(zhì)粒構(gòu)建的一些基本知識，在本期中將繼續(xù)為大家?guī)碣|(zhì)粒構(gòu)建相關(guān)的干貨，在本文中將為大家簡單介紹一下Kozak序列，并教大家如何在構(gòu)建質(zhì)粒之時添加Flag/HA等標(biāo)簽、如何判斷該載體上的酶切位點(diǎn)是否有移碼以及如何添加堿基避免移碼等知識。

另外，關(guān)于質(zhì)粒構(gòu)建的相關(guān)資料（包括相關(guān)軟件、常見標(biāo)簽序列等）已經(jīng)打包上傳，需要的可以在公眾號內(nèi)回復(fù)“質(zhì)粒構(gòu)建”獲取下載鏈接。

1. 認(rèn)識Kozak序列；
2. 懂得如何在構(gòu)建質(zhì)粒時添加標(biāo)簽序列；
3. 學(xué)會判斷載體的移碼規(guī)則；

- 不用保護(hù)堿基咩？嗯？

- 限制性內(nèi)切酶識別特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白還要占據(jù)識別位點(diǎn)兩邊的若干個堿基，這些堿基對內(nèi)切酶穩(wěn)定的結(jié)合到DNA雙鏈并發(fā)揮切割DNA作用時有很大影響的，被稱為保護(hù)堿基。

因此在設(shè)計PCR引物時，為保護(hù)5’端外加的酶切位點(diǎn)，故在酶切位點(diǎn)的5’端添加額外的堿基序列來提高酶切時的活性，使酶切更完全。

所以我們構(gòu)建質(zhì)粒設(shè)計引物時經(jīng)常會添加保護(hù)堿基，不過，現(xiàn)在很多實驗室都是使用的快酶，所以個人認(rèn)為添不添加保護(hù)堿基對酶切效率的影響有限，當(dāng)然這是純推測結(jié)果，不放心的可以加上，小編比較任性，有時候加有時候不加……

- 再弱弱地問一下：PCR時的模板可不可以直接提DNA？

- 不可以?；蚪MDNA有內(nèi)含子。而我們抽提的RNA一般都是成熟的mRNA，在轉(zhuǎn)錄過程中內(nèi)含子已被剪切掉，當(dāng)使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄出的cDNA并不會含有內(nèi)含子，這種的才是適合用來質(zhì)粒構(gòu)建的。當(dāng)然你有該基因的表達(dá)質(zhì)粒也是可以作為PCR模板的。

KOZAK是一個女科學(xué)家，她研究過起始密碼子AUG周邊堿基定點(diǎn)突變后對轉(zhuǎn)錄和翻譯所造成的影響，并總結(jié)出在真核生物中，起始密碼子兩端序列為：

—— G/N-C/N-C/N-ANNAUGG——，如GCCACCAUGG、GCCAUGAUGG時，轉(zhuǎn)錄和翻譯效率最高，特別是-3位的A對翻譯效率非常重要。該序列被后人稱為Kozak序列，并被應(yīng)用于表達(dá)載體的構(gòu)建中。

所謂Kozak規(guī)則，即第一個AUG側(cè)翼序列的堿基分布所滿足的統(tǒng)計規(guī)律，若將第一個AUG中的堿基A，U，G分別標(biāo)為1，2，3位，則Kozak規(guī)則可描述如下：
(1)第4位的偏好堿基為G；
(2)AUG的5’端約15bp范圍的側(cè)翼序列內(nèi)不含堿基T；
(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好堿基；
(4)除-3，-6和-9位，在整個側(cè)翼序列區(qū)，C是偏好堿基。

Kozak規(guī)則是基于已知數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結(jié)果，不見得必須全部滿足，一般來說，滿足前兩項即可。

真核引物設(shè)計需在AUG前加上GCCACC。【注：以上資料來源于百度百科】

例如在《質(zhì)粒構(gòu)建：從入門到精通之初窺門徑》中設(shè)計的引物如下

加上Kozak序列后：

另外，現(xiàn)在的過表達(dá)載體都有很強(qiáng)的啟動子，加不加Kozak序列對表達(dá)效率的影響有限。大家可以自行決定是否添加。

在構(gòu)建過表達(dá)載體時，常常需要添加諸如Flag、HA、Myc等標(biāo)簽，然而我選的載體上并沒有標(biāo)簽怎么辦？

比如我們在《質(zhì)粒構(gòu)建：從入門到精通之初窺門徑》中選擇的pcDNA3.0就沒有相應(yīng)的標(biāo)簽，可是我需要添加標(biāo)簽怎么辦？

這個時候我們就需要在設(shè)計引物的時候?qū)?biāo)簽序列添加到引物上，這樣PCR出來的目的基因序列就自帶標(biāo)簽了。

下面我們就以在PDCD1引物上添加Flag為例進(jìn)行講解：

之前我們設(shè)計好的PDCD1引物為：

那么問題來了，我們到底是把標(biāo)簽添加到5’端還是3’端呢？在這里先不回答這個問題，我們先看看5’端和3’端分別怎么添加標(biāo)簽吧。

注意了，我們這里講的5’端和3’端是基因序列的5’端和3’端，不是引物和其他序列的。

Flag蛋白序列一般為DYKDDDDK，密碼子為：GAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG。所以5’端和3’端加入標(biāo)簽后分別為：

5’端的序列大家可能比較好理解，這里需要提醒一下如果加在ATG前面需要在Flag序列前面也加上ATG，而目的基因的ATG 可以刪除也可以保留，當(dāng)然建議保留。

3’端當(dāng)然得加在終止密碼子前面了！而對于3’端序列可能有些讀者反應(yīng)不過來，為了便于理解，你可以直接將標(biāo)簽序列加在CDS序列的3’端上，即將標(biāo)簽序列當(dāng)做CDS的一部分，這樣再設(shè)計引物就比較好理解為什么3’端的序列是這樣子的了。

如下圖：

可能有讀者擔(dān)心，這樣引物不就有很大一部分序列無法與模板匹配了么？其實根本不用擔(dān)心，只要引物3’端是結(jié)合在模板上的就可以了。如下圖：

這樣我們PCR出來的基因就是帶標(biāo)簽的了，只要連接入載體中就可以了。

最后我們回到一開始的問題，我們到底是把引物添加到5’端還是3’端呢？這個的選擇主要是看我們的目的基因，比如我們選擇的PDCD1這個基因就比較特殊！

因為它的5’端是信號肽（Signal Peptide），而信號肽一般都會在蛋白成熟過程中被切割掉，所以如果你加在5’端，用Flag抗體做WB是檢測不到Flag-PDCD1的！

如何看出來這個基因有信號肽呢？

我們在NCBI上查詢CDS時有下圖：

你也可以去UniProt上查詢該序列信息：

我們可以看出來，PDCD1的前18個氨基酸組成了信號肽，而當(dāng)你點(diǎn)擊Signal peptide的時候，UniProt給了如下解釋：

The signal sequence is usually removed in the mature protein; in these cases, the comment ‘The displayed sequence is further processed into a mature form’ is added in the ‘Sequence’ section.

PDCD1序列信息部分如下圖：

所以無論是在NCBI上還是UniProt上都可以查到PDCD1的信號肽是要被切割掉的！不能加在5’端，只能加在3’端。當(dāng)然還有一些需要考慮對蛋白功能的影響等來決定標(biāo)簽加在哪一端。

我們在設(shè)計引物時基本是不需要考慮移碼的，因為ATG后面就是我們的目的基因了。

然而有些載體是自帶標(biāo)簽的，這個時候一般都要考慮是否移碼，當(dāng)然很多帶標(biāo)簽的載體也是已經(jīng)優(yōu)化好，無需考慮移碼！

但是，如果我選的載體就是要考慮移碼怎么辦？我們就以下面的載體為例：

我們可以看到，當(dāng)該載體表達(dá)時，是從Flag標(biāo)簽的ATG表達(dá)的，密碼子都是三個一組；所以順序表達(dá)下去，當(dāng)表達(dá)到BamHI時，剛剛好，不移碼；BamHI的TCC直接加目的基因ATGXXX就可以正確表達(dá)了。

然而當(dāng)我們不選BamHI而選擇EcoRI時，發(fā)現(xiàn)變?yōu)榱薌GA ATT C+ATGXXX，如果我們直接不加以改造就成了CAT GXX X……，這樣我們的目的基因就移碼了，而如果不需要移碼就需要在酶切位點(diǎn)之后添加2個堿基，變?yōu)镚GA ATT CXX ATGXXX，這樣我們的目的基因就不會移碼了：

按照上述規(guī)則，大家可以試試是否能推出各個酶切位點(diǎn)的移碼規(guī)則！

到這里我們就把質(zhì)粒構(gòu)建的知識基本講完啦。