|
首先，根據(jù)目的基因CDS序列的長短，可以通過兩種方法獲取目的基因序列： （1）設(shè)計CDS引物，通過提取組織RNA，并設(shè)計相應(yīng)引物，運(yùn)用PCR的方法獲得目的基因CDS序列，連接到克隆載體后，挑取單克隆進(jìn)行測序。這種方法相對成本較低，但是PCR過程可能引入突變。適合基因CDS序列較短的情況。 （2）全基因合成：根據(jù)目的基因的CDS序列，直接交給公司設(shè)計合成目的基因。此方法優(yōu)點(diǎn)準(zhǔn)確性高，相對成本會高一些，需要專業(yè)的合成公司完成。適合基因CDS序列較長或者人工改造的任何基因序列。有些公司會將目的CDS序列連接至克隆質(zhì)粒載體上，此時我們可以通過兩種方法獲得：A：CDS兩端限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，將酶切后片段通過膠回收方式連接至載體。B：設(shè)計引物將CDS區(qū)通過PCR方法獲取，注意如果序列較長，最好使用高保真酶，防止PCR過程中堿基突變。 下面以人類基因?yàn)槔?，介紹下第一種方法中目的基因的獲取。 1目的基因的CDS序列獲取 1.進(jìn)入NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm./pubmed） 2.選擇ROR1基因，種屬來源，如人類。 3.點(diǎn)擊ROR1基因進(jìn)入，下拉網(wǎng)頁找到mRNA,在這里我們隨機(jī)選擇第二個轉(zhuǎn)錄本，點(diǎn)擊NM_001083592.1，獲得基因序列的CDS區(qū)。 4.獲取目的基因序列。 2目的基因的CDS序列引物設(shè)計 基因過表達(dá)，既需要將基因的CDS序列完整序列克隆至表達(dá)載體。 （1）獲得CDS序列后，通過DNAuser軟件分析一下目的基因的酶切位點(diǎn)。打開DNAuser軟件后，將CDS序列復(fù)制粘貼至對話框，點(diǎn)擊限制性內(nèi)切酶圖譜進(jìn)行位點(diǎn)分析。 （2）CDS的獲取 通過Trizol法提取野生型組織或細(xì)胞RNA，步驟簡單概括為：加入Trizol裂解--加入氯仿抽提--離心--加入氯丙醇沉淀--離心--酒精洗滌--離心--溶解。 得到RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到目的基因的CDNA。 （3）根據(jù)目的質(zhì)粒上限制性酶切位點(diǎn)的情況，設(shè)計對應(yīng)的引物，以CDNA為模板，進(jìn)行PCR,得到包含酶切位點(diǎn)的全長CDS序列。 A:連接法引物設(shè)計。 5‘-保護(hù)序列+限制型酶切位點(diǎn)+CDS起始后20個堿基 下游引物設(shè)計： 5‘-保護(hù)序列+限制型酶切位點(diǎn)+CDS結(jié)束前20個堿基的反補(bǔ)序列 雙酶切時，需要在酶切位點(diǎn)前面加上保護(hù)堿基，以保證最佳的酶切效率。選取酶切效率最高的保護(hù)堿基。 B:重組法引物設(shè)計： 上游引物設(shè)計： 5‘-載體序列20個堿基+限制型酶切位點(diǎn)+CDS起始后20個堿基 下游引物設(shè)計： 5‘-載體序列20個堿基+限制型酶切位點(diǎn)+CDS結(jié)束前20個堿基的反補(bǔ)序列 （4）PCR擴(kuò)增CDS序列 由于基因CDS序列一般較長，1kb-3kb之間可以通過PCR的方法，序列過長最好選用專門的試劑盒或者交給公司。即便如此，在擴(kuò)增過程中，一定要選擇高保真酶，防止引入突變。 PCR的程序可以選擇兩步法，也可以選擇三步法，重點(diǎn)在延伸階段，可以根據(jù)1kb/30s進(jìn)行設(shè)定，循環(huán)數(shù)最好設(shè)置為35-40。 A:兩步法
B:三步法
（5）CDS序列與質(zhì)粒載體連接。 A：連接法：T4連接酶
目前T4連接酶大多是快速連接酶，可以選擇16度進(jìn)行10-30分鐘，或者選擇4度連接過夜。 B：重組法：重組酶
37度水浴30min后置于冰水浴中冷卻5 min即可。 （6）將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體菌中（一般為DH5a）,涂板,培養(yǎng)過夜后，挑取單克隆菌落進(jìn)行測序，驗(yàn)證序列正確性。 （7）細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行驗(yàn)證過表達(dá)效率。 |
|
|
