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質(zhì)粒構(gòu)建是分子生物學(xué)研究中最常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。原理依賴于限制性核酸內(nèi)切酶，DNA 連接酶和其他修飾酶的作用，分別對目的基因和載體 DNA 進(jìn)行適當(dāng)切割和修飾后，將二者連接在一起，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的正確表達(dá)。 質(zhì)粒構(gòu)建方式多樣，常規(guī)的 T4 連接酶，以及最近更受歡迎的重組酶方式。下面小編就總結(jié)一下 T4 連接酶與重組酶構(gòu)建質(zhì)粒方法，通過比較，其最大的不同點(diǎn)可能在于目的基因的設(shè)計(jì)以及連接體系。 壹 一. T4 DNA Ligase 即 T4 DNA 連接酶，可以催化粘端或平端雙鏈 DNA 或 RNA 的 5’-P 末端和 3’-OH 末端之間以磷酸二酯鍵結(jié)合，該催化反應(yīng)需 ATP 作為輔助因子。 1. 質(zhì)粒載體的制備既可以選擇單酶切也可以選擇雙酶切，一般推薦使用雙酶切。其實(shí)目的就只有一個，盡量使載體的末端具有特異性，防止自連。 [可選酶切體系] VECTOR 3 ug CutSmart Buffer 5 ul 限制性內(nèi)切酶 1 1 ul 限制性內(nèi)切酶 2 1 ul 酶切體系一般選擇 50ul，試劑加好之后 37°C 孵育 6~8 小時，或適當(dāng)延長時間，保證質(zhì)粒酶切完全。每隔一段時間振蕩一下并離心以防液滴蒸發(fā)至管蓋上。酶切后載體通過切膠回收線性化載體。 2.根據(jù)目的序列構(gòu)建引物后，引物設(shè)計(jì)原則簡單總結(jié)一下: （1）前向引物：5’ 端-保護(hù)堿基序列+限制性內(nèi)切酶 1 酶切位點(diǎn)序列+基因正向引物序列 -3’ 端 （2）反向引物：5’ 端-保護(hù)堿基序列+限制性內(nèi)切酶 2 酶切位點(diǎn)序列+基因反向引物序列 -3 ’端 如果目的基因片段較長的話，可以選擇 PCR 方式擴(kuò)增目的基因片段 [可選 PCR 擴(kuò)增體系] ddH2O：14ul 10xTaq buffer：2ul 10um DNTP：1ul 10um primer F：0.5ul 10um primer R：0.5ul 模板 DNA：1ul Taq 酶：1ul [可選 PCR 擴(kuò)增條件] (1)95℃：5min (2) 35cycle 95℃：30s 55℃：30s（退火溫度可以根據(jù)目的引物TM值決定，一般退火溫度根 據(jù)引物TM值降低5度） 72℃：40s (3)72℃：10min (4)16℃：hold 引物擴(kuò)增之后，首先要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證條帶大小，然后通過膠回收，獲得純化目的片段產(chǎn)物.由于加入保護(hù)堿基，回收產(chǎn)物需要進(jìn)行雙酶切，雙酶切方法與質(zhì)粒酶切方法相同。 3. 載體與目的基因的連接，推薦在 10~20μl 反應(yīng)體系中進(jìn)行接反應(yīng)。 [可選連接體系] 載體 25 ng 退火產(chǎn)物 2 ul 10 x T4 buffer 1 ul T4 DNA ligase 1 ul T4 連接酶一般選擇 4 度過夜 4. 轉(zhuǎn)化 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體菌中（一般為 DH5a），涂板，培養(yǎng)過夜。 5. 挑取單克隆，并鑒定 挑去平板上的單克隆培養(yǎng)，可以通過 PCR 或者酶切初步鑒定陽性克隆，對初步鑒定出來的陽性克隆進(jìn)行測序。 貳 下面開始重點(diǎn)介紹重組酶構(gòu)建質(zhì)粒，基于同源基因重組原理，適用于向幾乎任何載體在任何位點(diǎn)進(jìn)行定向克隆，無需考慮插入片段自身攜帶的酶切位點(diǎn)可高效克隆 50 bp～10 kb 片段，同時構(gòu)建時間也大大縮短。 1. 載體的制備一般推薦雙酶切線性化，線性化完全，假陽性克隆低。酶切體系同上。 2. 對于使用重組方式連接來說，PCR 要設(shè)計(jì)引物, 設(shè)計(jì)引物時要根據(jù)質(zhì)粒載體和基因序列選擇合適的同源序列，通過 PCR 擴(kuò)增方式進(jìn)行連接，PCR 的產(chǎn)物要純化。 引物設(shè)計(jì)原則簡單總結(jié)一下： （1）前向引物：5’ 端--上游克隆載體末端同源序列+基因正向擴(kuò)增引物--3’ 端 （2）反向引物：3’ 端--基因反向擴(kuò)增引物+下游克隆載體末端同源序列--5’ 端 如果設(shè)計(jì)的基因特異插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物長度較長，可以選擇 PCR 方式進(jìn)行目的引物的擴(kuò)增。 [可選 PCR 擴(kuò)增體系] ddH2O 14 ul 10 x Taq buffer 2 ul 10 um DNTP 1 ul 10 um primer F 0.5 ul 10 um primer R 0.5 ul Vector 1 ul Taq 酶 1 ul [可選 PCR 擴(kuò)增條件] (1)95℃：5min (2) 35cycle 95℃：30s 55℃：30s（退火溫度可以根據(jù)目的引物TM值決定，一般退火溫度根 據(jù)引物TM值降低5度） 72℃：40s (3)72℃：10min (4)16℃：hold PCR 擴(kuò)增后，通過膠回收方式獲得純化的 PCR 產(chǎn)物。純化后的 PCR 產(chǎn)物不需要進(jìn)行酶切，直接用于重組反應(yīng)。 3. 目的引物與線性載體進(jìn)行重組反應(yīng)。 [可選重組體系] 5 × CE II Buffer 4 μl 線性化克隆載體 50～200 ng 插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物 20～200 ng Exnase? II 2 μl ddH2O x ul 在冰水浴中配制，配制完成后，用移液器上下輕輕吹打幾次混勻各組分，置于 37 ℃ 反應(yīng) 30 min。待反應(yīng)完成后，立即將反應(yīng)管置于冰水浴中冷卻 5 min。重組效率在反應(yīng) 30 min 左右達(dá)到最高，反應(yīng)時間不足或者太長都將會降低克隆效率，這樣大大減少了連接時間。 4. 轉(zhuǎn)化 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體菌中（一般為 DH5a），涂板，培養(yǎng)過夜。 5. 挑取單克隆，并鑒定 挑去平板上的單克隆培養(yǎng)，可以通過 PCR 或者酶切初步鑒定陽性克隆，對初步鑒定出來的陽性克隆進(jìn)行測序。 最后，幾個主要注意事項(xiàng)： 1. 載體克隆位點(diǎn)選擇盡量選擇無重復(fù)序列，且 GC 含量比較均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆。當(dāng)克隆位點(diǎn)上下游 20 bp 區(qū)域內(nèi) GC 含量均在 40%～60% 范圍之內(nèi)時， 克隆效率將達(dá)到最大. 2. 最適克隆載體與插入片段摩爾比為 1:2，即最適插入片段使用量為 0.06 pmol。這些摩爾數(shù)對應(yīng)的 DNA 質(zhì)量可由以下公式粗略計(jì)算獲得： 最適克隆載體使用量 = [0.02 × 克隆載體堿基對數(shù)] ng（0.03 pmol） 最適插入片段使用量 = [0.04 × 插入片段堿基對數(shù)] ng（0.06 pmol） 3. 雙酶切 1 和 2，在設(shè)置酶切體系時要考慮酶切溫度以及 Activity in NEBbuffer 的問題，可在 NEB 公司主頁的 Double Digest Finder 里面進(jìn)行查詢。 想要做好質(zhì)粒構(gòu)建，試劑盒的選取十分重要，Omega 的質(zhì)粒提取試劑盒比較優(yōu)質(zhì)，國內(nèi)有很多代理商可以提供，掃描下方二維碼，可以索取相關(guān)技術(shù)資料以及產(chǎn)品信息。
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