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16S的基礎(chǔ)概念 16S rDNA是細菌的系統(tǒng)分類研究中最有用的和最常用的分子鐘，其種類少，含量大（約占細菌RNA含量的80％），分子大小適中，存在于所有的生物中，其進化具有良好的時鐘性質(zhì)，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性，素有“細菌化石”之稱。在大多數(shù)原核生物中rDNA都具有多個拷貝，5S、16S、23S rDNA的拷貝數(shù)相同。16S rDNA由于大小適中，約1.5Kb左右，既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術(shù)較容易地得到其序列，故被細菌學(xué)家和分類學(xué)家接受。 關(guān)鍵詞：普遍、保守、大小適中、可變區(qū)！ 1、16S rRNA 普遍存在于原核生物中。 rRNA 參與生物蛋白質(zhì)的合成過程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物進化的漫長歷程中保持不變，可看作為生物演變的時間鐘。 2、在 16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，因而它適用于進化距離不同的各類生物親緣關(guān)系的研究。 3、16S rRNA 的相對分子量大小適中，約 1540 個核苷酸，便于序列分析。 4、可變區(qū)序列因細菌不同而異，恒定區(qū)序列基本保守，所以可利用恒定區(qū)序列設(shè)計引物，將16S rDNA片段擴增出來，利用可變區(qū)序列的差異來對不同菌屬、菌種的細菌進行分類鑒定。 16S的結(jié)構(gòu) 16S rRNA基因序列包括9個可變區(qū)和10個保守區(qū)，保守區(qū)序列反映了物種間的親緣關(guān)系，而可變區(qū)序列則能體現(xiàn)物種間的差異。 16S擁有9個可變區(qū)域，其結(jié)構(gòu)和分布，如下圖所示： 基于16S全長的菌種鑒定 （一代測序技術(shù)） 工作對象：已培養(yǎng)的純菌落 所用技術(shù)：一代測序儀3730 工作流程： 常用引物序列： 試劑成本： <100元 優(yōu)點：可輔助常規(guī)菌種鑒定方法，如顯微形態(tài)和培養(yǎng)特征以及理化特性包括營養(yǎng)類型、碳氮源利用能力、各種代謝反應(yīng)、酶反應(yīng)和血清學(xué)反應(yīng)等方法，提高菌種鑒定的準確度。 缺點：僅能用于純菌！僅能用于純菌！僅能用于純菌！ 基于16S的菌群結(jié)構(gòu)分析（二代測序技術(shù)） 工作對象：臨床樣本（如糞便、腦脊液、血液、尿液等）、環(huán)境樣本（土壤、污水等） 所用技術(shù)：二代測序儀，如Illumina的Hiseq和Miseq、Thermo的Ion Torrent，以及Roche的454（已停產(chǎn)） 工作流程： 部分常用引物序列： 試劑成本：~400元/樣本 優(yōu)點：通過檢測16S rDNA的序列變異和豐度，反映樣本中細菌的分類和豐度,獲得樣本物種分類，物種豐度，種群結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)進化，群落比較等諸多信息，可用于臨床樣本的未知病原菌檢測。 缺點：（1）受限于二代測序的讀長，目前只能最多測16S九個可變區(qū)中的2個，一般為V3-V4區(qū)。因此對菌群的分辨率，部分菌種只能分辨到屬水平。 （2）缺少SOP實驗方案。不同實驗因素對實驗結(jié)果影響較大。詳情可參照前貼 【好文共賞】宏基因組實驗的那些坑-16S擴增子建庫方法的各影響因素 （3）相較于WGS宏基因組測序，16S宏基因組也可用于功能學(xué)方面研究，但不準確。詳情可參照前貼 微微，我想測個序?。ê昊蚪M篇） 16S的未來：三代測序技術(shù) 讀長短分辨率低咋辦？上三代測序?。?br> Pacbio測序技術(shù)用于16S宏基因組，已有相關(guān)的文獻發(fā)表 參考文章：High-resolution phylogenetic microbial community profiling 一次上機測通9個可變區(qū)，分辨率高，準確度高，更適用于臨床樣本中未知病原檢測和其他科學(xué)研究應(yīng)用。 可惜，由于未解決樣本pooling等原因，其價格居高不下，目前還在八千元一個樣本的水平，高昂的費用極大的制約了科研人員使用的積極性。 此外，新近進入中國市場的Nanopore目前尚未由應(yīng)用于16S的實際案例出現(xiàn)。相較于Pacbio，Nanopore測序技術(shù)在靈活度方面更勝一籌，是否能用于16S相關(guān)研究，筆者對其報以極大的期待。 以上部分資料參考于網(wǎng)絡(luò)，并感謝宏基因組討論群各位老師提供相關(guān)資源，在此致謝。 |
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