技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及高通量測序領(lǐng)域，具體而言，涉及一種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

對于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序來說，轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建是主要的難點，因為單細(xì)胞中mRNA含量低至10pg，無法通過常規(guī)的RNA轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建方法來構(gòu)建。因此，目前市場上能夠利用如此少量的mRNA進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫構(gòu)建的產(chǎn)品一般在獲得預(yù)擴(kuò)增cDNA后采用Illumina公司的DNA文庫構(gòu)建試劑盒(illumina Nextera XT DNA sample preparation kit)。

Illumina公司的該試劑盒是采用化學(xué)方法對樣品進(jìn)行片段化，即用轉(zhuǎn)座酶對cDNA進(jìn)行打斷的方式建庫。單細(xì)胞經(jīng)裂解后，mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后對cDNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增后，采用轉(zhuǎn)座酶打斷的方式對cDNA進(jìn)行片段化處理。于此同時，轉(zhuǎn)座酶在打斷的同時會在破碎片段的兩端加上接頭，然后再經(jīng)PCR對片段進(jìn)行富集，該步驟中PCR的引物會在破碎片段的兩端帶上標(biāo)簽序列(index)，加標(biāo)簽序列的目的是給不同的樣品帶上不同的標(biāo)簽，以便從得到的混合測序數(shù)據(jù)中分離出各樣品所對應(yīng)的測序數(shù)據(jù)。Illumina公司的上述DNA文庫構(gòu)建試劑盒具有能從低至1ng的樣品起始量進(jìn)行文庫構(gòu)建的巨大優(yōu)勢，但采用上述試劑盒所構(gòu)建的測序文庫存在插入峰很寬的問題，大約在300bp～1000bp之間。文庫峰寬的寬窄會對上機(jī)定量的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響上機(jī)量和產(chǎn)出。文庫峰寬越寬，定量的偏差就越大。因而存在文庫上機(jī)定量的不準(zhǔn)，數(shù)據(jù)量產(chǎn)出不穩(wěn)定的問題。因為如果是數(shù)據(jù)產(chǎn)出過量，浪費成本；如果產(chǎn)量不足，還需要后期額外加測，耽誤項目周期。

為了克服上述缺陷，現(xiàn)有技術(shù)中采用物理破碎的方式對反轉(zhuǎn)得到的cDNA進(jìn)行打斷，使破碎片段較小且相對均勻，進(jìn)而使得所構(gòu)建的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的峰寬較為集中；且片段化后的樣品不經(jīng)純化步驟減少了樣品損失不僅能夠?qū)崿F(xiàn)微量樣品的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建，而且還能增加數(shù)據(jù)量產(chǎn)出的穩(wěn)定性，從而提高了大規(guī)模單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組文庫高通量測序的可靠性。

但在打斷之前都需要經(jīng)過預(yù)擴(kuò)增的步驟，以使cDNA的量能夠滿足建庫所需，然而這種物理破碎的方式對cDNA進(jìn)行打斷，會使得所構(gòu)建的文庫中含有預(yù)擴(kuò)增的引物污染，約占數(shù)據(jù)總量的20％，造成數(shù)據(jù)的浪費。

因此，仍需要對現(xiàn)有的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建方法進(jìn)行改進(jìn)，以減少所構(gòu)建的文庫中的預(yù)擴(kuò)增引物污染。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的在于提供一種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，用以減少所構(gòu)建的文庫中的預(yù)擴(kuò)增引物污染片段。

為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法包括以下步驟：直接對單細(xì)胞的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；用擴(kuò)增引物對cDNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，得到擴(kuò)增cDNA；對擴(kuò)增cDNA進(jìn)行片段化文庫構(gòu)建，得到單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測序文庫；其中，擴(kuò)增引物中的dTTP替換為dUTP。

進(jìn)一步地，對cDNA進(jìn)行片段化文庫構(gòu)建的步驟包括：步驟S1，對cDNA采用物理破碎的方式進(jìn)行片段化，得到片段化樣品；步驟S2，對片段化不經(jīng)過純化直接進(jìn)行末端修復(fù)，同時添加腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，得到修復(fù)后樣品；步驟S3，對修復(fù)后樣品進(jìn)行接頭連接，得到帶接頭樣品；步驟S4，對帶接頭樣品進(jìn)行擴(kuò)增，得到單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測序文庫。

進(jìn)一步地，在得到帶接頭樣品之后，以及對帶接頭樣品進(jìn)行擴(kuò)增之前，還包括對帶接頭樣品進(jìn)行消化的步驟，消化步驟中用ESUR酶進(jìn)行消化。

進(jìn)一步地，物理破碎的方式為采用自動聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220對cDNA進(jìn)行片段化；優(yōu)選自動聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220對cDNA進(jìn)行片段化時的參數(shù)設(shè)置為：循環(huán)數(shù)8％～12％，峰值入射功率170～180瓦；循環(huán)數(shù)/爆發(fā)200～220個；時間300～360s；溫度4～8℃。

進(jìn)一步地，自動聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220對cDNA進(jìn)行片段化后得到的片段化樣品的長度為150～200bp。

進(jìn)一步地，在得到片段化樣品之后，以及對片段化樣品進(jìn)行末端修復(fù)的步驟之前，還包括對片段化樣品進(jìn)行濃縮的步驟；優(yōu)選采用Thermo Scientific公司的Thermo Scientific DNASpeed111V離心濃縮系統(tǒng)。

進(jìn)一步地，在步驟S2中采用NEB公司的末端修復(fù)酶試劑組合對片段化樣品不經(jīng)純化直接進(jìn)行末端修復(fù)，同時添加腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，末端修復(fù)酶試劑組合包括10×的NEBNext末端修復(fù)反應(yīng)緩沖液和NEBNext末端制備酶混合物；在步驟S3中采用NEB公司的平末端/粘性TA末端連接酶混合物和NEBNext接頭對修復(fù)后樣品進(jìn)行接頭連接；在步驟S4中采用KAPA BIO公司的2×的KaPA HiFi反應(yīng)混合物對接頭樣品進(jìn)行擴(kuò)增。

進(jìn)一步地，當(dāng)片段化樣品的量低至3ng時，在步驟S3中，對接頭進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行接頭連接；優(yōu)選將接頭稀釋至1.0～2.0μM；更優(yōu)選稀釋至1.5μM。

進(jìn)一步地，在步驟S4中，擴(kuò)增的循環(huán)次數(shù)為10～15次，優(yōu)選13次。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了上述任一種構(gòu)建方法在研究細(xì)胞異質(zhì)性方面的應(yīng)用。

應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，在常規(guī)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建的基礎(chǔ)上，通過將預(yù)擴(kuò)增引物中的dTTP替換為dUTP，使得本發(fā)明的在接頭連接之后進(jìn)行的酶消化步驟，不僅能夠?qū)型接頭打斷使雙鏈分別帶上接頭序列，而且能將帶接頭片段中含有預(yù)擴(kuò)增引物的片段打斷，并在后續(xù)文庫擴(kuò)增步驟的高溫預(yù)變性及變性步驟中去除，進(jìn)而減少了帶預(yù)擴(kuò)增引物的片段的擴(kuò)增，使得產(chǎn)出的測序數(shù)據(jù)中帶有預(yù)擴(kuò)增引物污染的數(shù)據(jù)比例也大大下降，從而大大提高了產(chǎn)出數(shù)據(jù)的有效數(shù)據(jù)量。

附圖說明

構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1示出了本發(fā)明的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫構(gòu)建流程的示意圖；

圖2示出了本發(fā)明的實施例中反轉(zhuǎn)錄得到的片段的大??；

圖3示出了按照本發(fā)明的方法所構(gòu)建的文庫的大?。?/p>

圖4示出了本發(fā)明所構(gòu)建的文庫中GC分離度和GC含量圖；以及

圖5示出了對本發(fā)明的文庫中的插入片段的評估結(jié)果。

具體實施方式

需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。

在本發(fā)明中的術(shù)語“單細(xì)胞”是指單一類型細(xì)胞的單個細(xì)胞；“微量樣品”是指起始量在3～20ng的cDNA樣品。

正如背景技術(shù)部分提到的，為了減少所構(gòu)建的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的產(chǎn)出數(shù)據(jù)中的引物污染數(shù)據(jù)，在本發(fā)明一種典型的實施方式中，如圖1所示，提供了一種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法包括以下步驟：對單細(xì)胞中的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；用擴(kuò)增引物對cDNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，得到擴(kuò)增cDNA；對擴(kuò)增cDNA進(jìn)行片段化文庫構(gòu)建，得到單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測序文庫；其中，擴(kuò)增引物中的dTTP替換為dUTP。

本發(fā)明的上述構(gòu)建方法，在常規(guī)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建的基礎(chǔ)上，通過將預(yù)擴(kuò)增引物中的dTTP替換為dUTP，使得本發(fā)明的在接頭連接之后進(jìn)行的酶消化步驟，不僅能夠?qū)型接頭打斷使雙鏈分別帶上接頭序列，而且能將帶接頭片段中含有預(yù)擴(kuò)增引物的片段打斷，并在后續(xù)文庫擴(kuò)增步驟的高溫預(yù)變性及變性步驟中去除，進(jìn)而減少了帶預(yù)擴(kuò)增引物的片段的擴(kuò)增，使得產(chǎn)出的測序數(shù)據(jù)中帶有預(yù)擴(kuò)增引物污染的數(shù)據(jù)比例也大大下降，從而大大提高了產(chǎn)出數(shù)據(jù)的有效數(shù)據(jù)量。

在本發(fā)明的上述文庫構(gòu)建方法中，在單細(xì)胞樣品裂解后，直接將細(xì)胞中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA。反轉(zhuǎn)錄的步驟通常包括：由細(xì)胞樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到第一鏈cDNA；對第一鏈cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到雙鏈的cDNA。

對上述得到的第一鏈cDNA和雙鏈cDNA最好都經(jīng)過純化的步驟，純化的步驟能夠使得樣品的純度更高，提高后續(xù)構(gòu)建所得到文庫的質(zhì)量。該步驟中可以采用市售的純化試劑盒進(jìn)行相應(yīng)的純化步驟，在本發(fā)明中，優(yōu)選使用Clontech公司的APRI Ampure XP磁珠進(jìn)行純化，該純化方法純化效率高，純化速度快，且操作更方便。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施例中，對cDNA進(jìn)行片段化文庫構(gòu)建的步驟包括：步驟S1，cDNA采用物理破碎的方式進(jìn)行片段化，得到片段化樣品；步驟S2，對片段化樣品不經(jīng)過純化直接進(jìn)行末端修復(fù)和添加腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，得到修復(fù)后樣品；步驟S3，對修復(fù)后樣品進(jìn)行接頭連接，得到帶接頭樣品；步驟S4，對帶接頭樣品進(jìn)行擴(kuò)增，得到單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測序文庫。