10×Genomics技術(shù)是由10×Genomics公司和Fred Hutchinson癌癥研究中心開(kāi)發(fā)出一種單細(xì)胞RNA測(cè)序方法，該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)數(shù)千個(gè)細(xì)胞的快速高效標(biāo)記、測(cè)序和分析，獲得單細(xì)胞水平的基因表達(dá)譜和差異情況，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞群體的劃分與細(xì)胞群體間差異表達(dá)基因的檢測(cè)。

10×Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的原理

10×Genomics平臺(tái)基于微滴的核酸條形碼分配系統(tǒng)，該系統(tǒng)提供了數(shù)以百萬(wàn)計(jì)級(jí)的攜帶唯一DNA條形碼的微滴，通過(guò)微流控技術(shù)，首先將帶有條形碼和引物的凝膠珠與單個(gè)細(xì)胞包裹在油滴（GEMs）中。凝膠珠溶解，細(xì)胞裂解釋放mRNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生用于測(cè)序的帶條形碼和UMI信息的cDNA。液滴油層破碎，cDNA擴(kuò)增，制備cDNA文庫(kù)，然后使用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，即可獲得大量單細(xì)胞的基因表達(dá)和免疫組庫(kù)數(shù)據(jù)。

技術(shù)核心–油滴包裹的凝膠珠（GEMs）

該系統(tǒng)有75萬(wàn)種barcoded beads，每個(gè)bead上有40-80萬(wàn)探針。

首先介紹（Gel bead）。Gel bead由凝膠珠和磁珠上的一段引物構(gòu)成。Gel bead上連接的引物序列包含四個(gè)部分：Illumina TruSeq Read 1測(cè)序引物、16 nt的條形碼（Barcode）、12 nt的UMI和30 nt的Poly(dT)反轉(zhuǎn)錄引物。

• TruSeq Read 1測(cè)序引物，為一段已知的短肽核苷酸序列，用于后續(xù)的上機(jī)測(cè)序。
• Barcode：有400萬(wàn)種Barcode，一個(gè)微珠對(duì)應(yīng)一種Barcode，通過(guò)這400萬(wàn)種Barcode，可以把凝膠微珠給區(qū)分開(kāi)。
• UMI是由隨機(jī)堿基組成的一段序列，每個(gè)DNA分子都有自己的UMI序列，在混合測(cè)序時(shí)，用于區(qū)分不同的樣本。能夠區(qū)分哪些reads是來(lái)自于一個(gè)原始cDNA分子，區(qū)分基因片段是重復(fù)還是duplication及區(qū)分是真實(shí)的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)還是PCR產(chǎn)生的突變。

Poly(dT)VN反轉(zhuǎn)錄引物，是含有30個(gè)T堿基的同聚DNA片段，一般具有啟動(dòng)子的作用。用于捕獲有polyA尾的轉(zhuǎn)錄本。其能夠在擴(kuò)增末端自動(dòng)加上三個(gè)C，在反應(yīng)buffer中的TSO酶含有三個(gè)G會(huì)與c互補(bǔ)，完成二鏈擴(kuò)增。

測(cè)序技術(shù)流程

1.將樣本制備成單細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞質(zhì)檢然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞活性測(cè)定，最終使細(xì)胞活性高于90%，細(xì)胞濃度為700～1200個(gè)細(xì)胞/μL。

2.取75μL Master Mix＋細(xì)胞懸浮液、40μL的含有barcode信息的凝膠珠和280μL的油滴分別加入到Chromium Chip B的不同小室，經(jīng)由微流體“雙十字”交叉系統(tǒng)形成油滴包裹的凝膠珠（Gel Bead-In-EMulsions，GEMs）。有效的GEMs包含凝膠珠、單細(xì)胞、Master Mix和油。

3.收集GEMs，并將其全部混合，凝膠珠在每個(gè)油滴內(nèi)自動(dòng)溶解釋放大量Barcode引物序列，細(xì)胞裂解釋放mRNA，mRNA與逆轉(zhuǎn)錄酶、凝膠珠上的poly dT反轉(zhuǎn)錄引物以及dNTP底物相接觸，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，產(chǎn)生用于測(cè)序的帶有Barcode和UMI信息的cDNA一鏈，再以SMART擴(kuò)增方法完成第二鏈合成。

4.cNDA片段化油滴破碎，磁珠純化cDNA一鏈，然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

5.cDNA擴(kuò)增完成后，首先利用化學(xué)方法將cDNA打斷成200-300bp左右的片段，通過(guò)末端修復(fù)、加A進(jìn)行cDNA片段篩選，P7 adaptor接頭連接Read2測(cè)序引物，并通過(guò)PCR擴(kuò)增引入樣品Index，最后進(jìn)行片段篩選，從而構(gòu)建含有P5和P7接頭的cDNA文庫(kù)。

6.最后構(gòu)建的文庫(kù)結(jié)構(gòu)如下：

7.文庫(kù)完成以后，進(jìn)行庫(kù)檢，cDNA文庫(kù)庫(kù)檢合格后，直接在Illumina的測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序完成之后，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

10×Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序優(yōu)點(diǎn)

• 簡(jiǎn)單便捷：集單細(xì)胞分選、擴(kuò)增、建庫(kù)于一體，自動(dòng)化程度高，無(wú)需人工操作。
• 細(xì)胞通量高：微流體“雙十字”交叉系統(tǒng)為8通道系統(tǒng)，每個(gè)通道最高可捕獲10000個(gè)細(xì)胞，8通道一次可檢測(cè)樣本細(xì)胞數(shù)可達(dá)500-80000個(gè)。
• 細(xì)胞捕獲效率高：?jiǎn)渭?xì)胞捕獲效率高達(dá)65%，可準(zhǔn)確鑒別稀有細(xì)胞類(lèi)型，利于稀有樣本或小細(xì)胞量類(lèi)型樣本研究。
• 周期短：理論上1天即可完成細(xì)胞懸液制備、單細(xì)胞捕獲、擴(kuò)增及建庫(kù)的所有的測(cè)序準(zhǔn)備工作。
• 真正意義的單細(xì)胞測(cè)序：?jiǎn)蝹€(gè)GEMs捕獲到多個(gè)細(xì)胞的概率極低（＜0.9%/1000cells）。
• 性?xún)r(jià)比高：與其它單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)相比，性?xún)r(jià)比更高。
• 細(xì)胞可適性高：對(duì)細(xì)胞大?。ㄖ睆匠^(guò)40μm細(xì)胞需要制備細(xì)胞核）及細(xì)胞類(lèi)型（組織類(lèi)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血液細(xì)胞、癌組織細(xì)胞、神經(jīng)類(lèi)細(xì)胞等）無(wú)限制。

10×Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序缺點(diǎn)

• 只分析帶poly(A)的RNA。
• 樣本要求高：?jiǎn)蝹€(gè)樣本細(xì)胞起始量達(dá)105-106個(gè)，活細(xì)胞數(shù)目至少超過(guò)80%，最好在90%以上。
• 非全長(zhǎng)信息：只能獲得3’端轉(zhuǎn)錄本信息。
• DNA建庫(kù)操作步驟較多。

10×Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序應(yīng)用

• 3’端單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
• 基因組組裝應(yīng)用
• 免疫組庫(kù)測(cè)序
• ATAC-seq
• 人全基因組及全外顯子組測(cè)序