前面給大家簡單的介紹了什么是免疫組庫。今天小編給大家介紹一種研究免疫組庫的方法。

    10X genomics單細胞VDJ測序是一種全面的研究免疫組庫的方法，能夠在單細胞基礎上對數(shù)百個至數(shù)萬個人或小鼠的T細胞和B細胞中適應性免疫反應的細胞背景和免疫組庫進行同時分析。再加上Feature Barcoding技術(shù)，還能檢測和分析更多的細胞數(shù)據(jù)——例如細胞表面標志物和抗原特異性等，從而加強免疫細胞表型分析，以及研究淋巴細胞和靶細胞之間的動態(tài)相互作用。目前該方法廣泛的應用于：

• 揭示克隆性、多樣性、抗原特異性以及細胞環(huán)境

• 對全長的V(D)J基因序列進行組裝和注釋

• 獲得單個T細胞TCR的α鏈和β鏈的配對序列信息

• 獲得單個B細胞的重鏈和輕鏈免疫球蛋白（Ig）配對序列，達到同種型分辨率

• 同時測定同一細胞的TCR、B細胞免疫球蛋白、細胞表面蛋白表達和5’基因表達

• 將配對的全長TCR α鏈和β鏈序列與TCR-pMHC特異性相關(guān)聯(lián)

• 同時測定基因表達和細胞表面蛋白表達

    我們先通過下面這個視頻來簡單的了解一下這個技術(shù)

下面我們來具體的看一下技術(shù)細節(jié)

    每一個凝膠珠子上帶有細胞Barcode，UMI和專門為VDJ測序設計的switch oligo。

    PolyT會跟mRNA的ployA尾巴結(jié)合，并以mRNA為模板反轉(zhuǎn)成cDNA，之后會在3'端加上3個C，這3個C剛好可以跟switch oligo末尾的3個G相結(jié)合。然后合成一條跟mRNA一樣的鏈，這個時候mRNA鏈就帶上了barcode和UMI，并且是mRNA的5'端帶上了。這個過程也叫做模板轉(zhuǎn)換。TSO就是template switch oglio的縮寫。注意這一步跟10X mRNA建庫是不一樣的，傳統(tǒng)的mRNA建庫，凝膠珠子上帶的oligo就是以polyT結(jié)尾的，剛好和mRNA的polyA尾結(jié)合，因此得到的是3'端的信息。而BCR和TCR的3'端為C區(qū)，一般C區(qū)很長，這樣就很難測到V區(qū)和D區(qū)的相關(guān)信息了，也得不到CDR3區(qū)域的信息，因此這里需要做模板轉(zhuǎn)換。

  在完成反轉(zhuǎn)錄和barcode連接之后，凝膠珠破裂，所有細胞的cDNA混合在一起。

  cDNA被分為兩部分，一部分正常建庫用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測序。而另一部分則通過巢式PCR，有針對性的富集VDJ基因編碼區(qū)域。

所以根據(jù)TCR和BCR，恒定C區(qū)的基因非常保守的原則，將C區(qū)的序列設計為引物，用相鄰的outer primer和inner primer進行擴增，這樣就能保證正確富集含有VDJ區(qū)域的基因了。之后會用酶進行酶切，得到不同長度的文庫，然后末端修復，連上一個A，連接illumina的測序接頭就可以上機測序了。

下面是最終上機測序的VDJ文庫和mRNA文庫

具體包括Illumina P5接頭，P5測序引物，16bp Barcode，10bp UMI，13bp Template Switch oligo（TSO）序列，插入cDNA片段，P7測序引物，樣本Index（i7-index read），IlluminaP7接頭。通過建庫，PCR擴增，上機測序等步驟，10X系統(tǒng)完成了對樣本中存在的VDJ基因重排信息的捕捉，以便查看樣本的BCR或TCR豐度和多樣性。

如何獲取全長VDJ序列

10X VDJ測序可以得到VDJ的全長序列，而VDJ的全長序列一般有~650bp，那么是如何通過2X150bp的reads來實現(xiàn)的呢？前面的原理里面提到過酶切，得到不同長度的片段，測序之后會對得到的reads進行拼接從而得到VDJ全長序列。