時間：2014-06-25 來源：學術(shù)堂

　　腫瘤多藥耐藥(multidrug-resistance,MDR)是指腫瘤對多種結(jié)構(gòu)和作用機制各不相同的化療藥產(chǎn)生交叉耐藥,是嚴重限制化療療效、甚至導致化療失敗的一個重要原因。據(jù)統(tǒng)計約有90%的癌癥化療失敗歸因于MDR[2],因此逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥是腫瘤治療的一個重要課題。對此國內(nèi)外眾多學者展開了大量研究,部分揭示了MDR的機制,并且篩選出一些對腫瘤多藥耐藥具有逆轉(zhuǎn)作用的藥物。由于西藥逆轉(zhuǎn)劑較大的不良反應、中藥單味藥逆轉(zhuǎn)劑臨床應用經(jīng)驗的缺乏等原因,目前能真正應用到臨床的MDR逆轉(zhuǎn)劑很少,近年來中藥復方逆轉(zhuǎn)劑的研究受到重視。芪竹方在臨床實踐中對腫瘤的治療具有增效減毒作用,因逆轉(zhuǎn)耐藥為中藥增效的機理之一,故推測芪竹方具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用。本研究以消化道常見腫瘤結(jié)腸癌及肝癌耐藥細胞株為研究對象,探索芪竹方對消化系腫瘤多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用。

　　

　　1 材料與方法

　　

　　1.1 細胞系結(jié)腸癌耐長春新堿耐藥細胞株HCT-8/V、肝癌耐5-FU耐藥細胞株Bel/FU、結(jié)腸癌非耐藥細胞株HCT-8均由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供。

　　

　　1.2 實驗動物SD大鼠,雌雄各半,體重250~300g,健康,由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供。

　　

　　1.3 方法

　　

　　1.3.1 芪竹方含藥血清的制備SD健康大鼠120只,雌雄各半,體重250~300g,觀察3d,精神、毛色等皆正常。隨機分為實驗組和對照組,實驗組大鼠以9.94mg/g劑量的芪竹方灌胃,2次/d,對照組予等體積蒸餾水灌胃,連續(xù)3d,末次給藥前12h禁食不禁水,末次給藥后1h,清醒狀態(tài)下摘眼球采血,無菌分離血清,經(jīng)56℃,35min滅活處理后,無菌操作臺上用0.22μm微孔濾膜過濾除菌,置-20℃保存?zhèn)溆谩?br>
　　

　　1.3.2 MTT法檢測芪竹方對HCT-8/V及Bel/FU細胞耐藥逆轉(zhuǎn)作用實驗設(shè)6組:芪竹方不同濃度4組(250μg/ml、50μg/ml、10μg/ml、2μg/ml)、維拉帕米陽性對照組1組、陰性對照組1組,每組5個復孔。取對數(shù)生長期HCT-8/V(或Bel/FU)細胞,以1×104/ml密度于100μl培養(yǎng)液中接種于96孔板,在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜后,實驗組加入不同濃度的芪竹方和不同濃度(100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml)的長春新堿(或氟尿嘧啶),陽性對照組加10μg/ml的維拉帕米和不同濃度的長春新堿(或氟尿嘧啶),陰性對照組僅加不同濃度長春新堿(或氟尿嘧啶),孔板再于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h,棄上清液,每孔加入50μlMTT(1mg/ml),再置培養(yǎng)箱中孵育4h,小心吸去孔內(nèi)上清液,每孔加入150μl二甲基亞砜,水平搖床上振蕩10min,在ELISA檢測儀上于波長490nm處讀取光密度值(OD值),求出生長抑制率,以濃度對數(shù)為橫軸,生長抑制率為縱軸,求濃度與抑制率之間的直線回歸方程,計算半數(shù)抑制濃度(IC50),并據(jù)IC50計算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=實驗組IC50÷對照組IC50。

　　

　　1.3.3 MTT法檢測芪竹方含藥血清對HCT-8/V及Bel/FU細胞耐藥逆轉(zhuǎn)作用實驗分以下6組:

　　

　　10%芪竹方含藥血清、20%芪竹方含藥血清、10%空白血清對照組,20%空白血清對照組、維拉帕米陽性對照組、陰性對照組,每組5個復孔。取對數(shù)生長期HCT-8/V(或Bel/FU)細胞,以1×104/ml密度于100μl培養(yǎng)液中接種于96孔板,在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜后,實驗組加入不同濃度(10%、20%)的芪竹方含藥血清或空白血清及不同濃度(100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml)的長春新堿(或氟尿嘧啶),陽性對照組加10μg/ml維拉帕米和不同濃度的長春新堿(或氟尿嘧啶),陰性對照組僅加不同濃度長春新堿(或氟尿嘧啶),以下步驟同實驗1.3.2。

　　

　　1.4 統(tǒng)計方法

　　

　　采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行處理,計量資料以x珚±s表示,組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

　　

　　2 結(jié)果

　　

　　2.1 芪竹方對HCT-8/V及Bel/FU細胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用芪竹方250μg/ml及50μg/ml濃度組可逆轉(zhuǎn)HCT-8/V細胞耐藥性(P<0.05),其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為14.65、6.20;與維拉帕米陽性對照組相比其逆轉(zhuǎn)作用無顯著性差異;芪竹方10μg/ml濃度組與芪竹方2μg/ml濃度組對HCT-8/V細胞無耐藥逆轉(zhuǎn)作用;芪竹方各濃度組對Bel/FU細胞無耐藥逆轉(zhuǎn)作用(表1)。

　　

　　2.2 芪竹方含藥血清對HCT-8/V及Bel/FU細胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用20%及10%空白血清無逆轉(zhuǎn)HCT-8/V細胞耐藥性作用;芪竹方20%及10%含藥血清可逆轉(zhuǎn)HCT-8/V細胞 耐 藥 性 (P<0.05),其 逆 轉(zhuǎn) 倍 數(shù) 分 別 為6.53、3.01,其中20%含藥血清與維拉帕米陽性對照組相比其逆轉(zhuǎn)作用無顯著性差異;10%含藥血清逆轉(zhuǎn)作用小于維拉帕米陽性對照組(P<0.05)(表2)。







　　

　　3 討論

　　

　　腫瘤多藥耐藥是一個多機制聯(lián)合作用產(chǎn)生的結(jié)果,腫瘤對一種化療藥物產(chǎn)生耐藥性后,對其他多種結(jié)構(gòu)和作用機制各不相同的藥物產(chǎn)生廣譜耐藥現(xiàn)象,導致藥物作用不斷下降,而逆轉(zhuǎn)多藥耐藥制劑的使用有助于減緩多藥耐藥,從而提高化療效果。

　　

　　目前認為腫瘤多藥耐藥與ABC轉(zhuǎn)運蛋白的高表達(如P-糖蛋白)、酶介導的MDR(如谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶)及控制凋亡的基因和蛋白的改變等有關(guān),研究的逆轉(zhuǎn)策略主要有運用P-糖蛋白抑制劑、酶抑制劑、細胞因子逆轉(zhuǎn)劑及基因治療等。盡管有一些化合物在進行臨床試驗,但到目前為止還沒有正式批準應用于臨床的腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑,因此尋找低毒、高效、高選擇性的MDR逆轉(zhuǎn)劑是當前研究的熱點。

　　

　　中醫(yī)藥用于腫瘤的治療及輔助治療已有千百年歷史,近年來大量研究顯示中藥單體及復方制劑通過多靶點、多環(huán)節(jié)作用于MDR逆轉(zhuǎn),增強抗腫瘤藥物的細胞毒作用,調(diào)節(jié)機體免疫功能,改善生活質(zhì)量。

　　

　　芪竹方由炙黃芪、玉竹等藥物組成,是一劑益氣養(yǎng)陰、化痰祛瘀、清熱解毒的復方,本實驗證實對腫瘤細胞無直接殺傷作用濃度的芪竹方及其含藥血清具有逆轉(zhuǎn)某些腫瘤多藥耐藥的作用,由此可認為益氣養(yǎng)陰、化痰祛瘀、清熱解毒法可能具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的功效,并逆推腫瘤多藥耐藥的形成可能與氣陰不足、痰結(jié)血瘀、熱毒熾盛有關(guān),其分子生物學機制有待于進一步深入的研究。

　　

　　本課題的研究對象是消化系的兩種腫瘤細胞株———HCT-8/V及Bel/FU,芪竹方及其含藥血清只對HCT-8/V細胞有耐藥逆轉(zhuǎn)作用,推測其原因是HCT-8/V與Bel/FU有著不同的耐藥機制,有待于進一步證實。藥物逆轉(zhuǎn)的具體作用靶點、凋亡途徑、信號轉(zhuǎn)導通路及與化療藥物的協(xié)同作用等尚需進一步研究,相信隨著腫瘤臨床及分子生物學的發(fā)展,中藥復方制劑逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的機制將被闡明,為臨床用藥提供指南。

　　

　　綜上所述,芪竹方及其含藥血清能體外逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌耐長春新堿細胞株HCT-8/V的耐藥性,而對Bel/FU細胞無體外逆轉(zhuǎn)作用。