1.WRN缺乏在MSI但不是MSS結直腸癌細胞中引發(fā)線粒體介導的凋亡

為了確定WRN損失對具有不同MMR狀態(tài)的CRC細胞的影響，作者使用小干擾RNA（siRNA）在3個MSI CRC細胞系（包括HCT116、RKO和LoVo）和2個MSS CRC細胞系（包括SW480和SW620）中敲低（KD）WRN。通過轉移攜帶野生型（WT）MLH1和MSH3的染色體3和5來糾正MMR缺陷的同源HCT116細胞（HCT116 CH3+5）（24）被用來進一步控制基因背景的影響。WRN耗竭顯著降低了MSI細胞的存活能力，這通過細胞存活性的MTS分析，可行細胞的結晶紫染色以及長期細胞存活的集落形成實驗得到證實。這些效應在MSS CRC細胞中明顯受阻。只有在WRN KD的MSI CRC細胞中才檢測到線粒體介導的凋亡標志物，包括Annexin V陽性染色，線粒體細胞色素c的胞質釋放以及caspase 3和9的裂解。在HCT 116細胞中，使用pancaspase抑制劑z-VAD-fmk（z-VAD）對細胞進行預處理，抑制了Si WRN引起的細胞存活率下降和凋亡。

2.WRN缺乏激活了MSI CRC細胞中的p53凋亡通路

為了確定WRN耗竭如何殺死MSI CRC細胞的機制，作者對轉染了Si WRN的母細胞和對照CH3+5 HCT116細胞進行了mRNA測序（RNA-Seq）。作者發(fā)現(xiàn)了超過3,000個差異表達基因，其中包括1,085個上調基因和1,997個下調基因，在HCT116細胞中，而在CH3+5細胞中只有990個改變的基因。基因集富集分析（GSEA）顯示，p53和凋亡途徑是WRN KD最顯著激活的途徑之一。所發(fā)現(xiàn)的變化包括眾所周知的p53下游靶基因，如p21（CDKN1A）、PUMA（BBC3）、Noxa（PMAIP1）、Gadd45 A和B、14-3-3σ以及Thrombospondin 1，以及其他凋亡調節(jié)因子，如BAK1、DR4、FAS、cIAP2和FLIP。這些數(shù)據(jù)促使作者進一步研究p53介導的凋亡信號傳導。作者發(fā)現(xiàn)，在HCT116細胞中，WRN KD 48小時后，p53被強烈誘導。與RNA-Seq數(shù)據(jù)一致，WRN KD顯著誘導了HCT116細胞中p53下游凋亡靶點的mRNA和蛋白表達，包括PUMA、Noxa和Bax，與p53誘導和caspase活化同時發(fā)生。這些效應在CH3+5細胞中幾乎沒有觀察到。

3.通過WRN耗竭誘導的p53介導的PUMA誘導對于殺死MSI CRC細胞至關重要

作者隨后調查了p53下游凋亡調節(jié)因子的功能作用。PUMA或BAX的敲除（KO），而不是Bim、Noxa或BAK，挽救了轉染Si WRN的HCT116細胞的存活能力，表明p53/PUMA/Bax軸在誘導凋亡中起到了關鍵作用。事實上，p53或PUMA的KO完全抑制了HCT116細胞中WRN KD引起的細胞存活能力喪失、細胞色素c釋放、Bax線粒體轉位以及caspase 3和9的裂解。在具有WRN KD的MSI LoVo細胞中也觀察到了p53和PUMA KO的類似效果。WRN KD在母細胞中激活了p53上游的DNA損傷信號，但在CH3+5 HCT116細胞中沒有激活，例如ATM（Ser1981）和Chk2（Thr68）的磷酸化。ATM激酶抑制劑Ku55933的處理抑制了WRN KD誘導的p53及其上游和下游信號的誘導，表明ATM/Chk2/p53介導的DNA損傷應答信號。綜上所述，這些結果表明WRN損失觸發(fā)了DNA損傷誘導的p53/PUMA介導的凋亡，以殺死MSI CRC細胞，這需要p53 K120乙?；?。

4.p53突變的微衛(wèi)星不穩(wěn)定結直腸癌細胞對WRN耗竭具有抗性，因為缺乏PUMA的誘導

p53基因突變在MSI腫瘤中相對較少，與MSS腫瘤相比（23）。廣泛使用的MSI結直腸癌細胞系大多表達野生型p53；但是一些細胞系表達突變型p53，包括DLD1和HCT15，它們具有相同的遺傳起源和p53突變（p.S241F），但具有不同的核型（33），以及KM12和LS411N（15, 16）。一項先前的研究顯示，在分析的18個MSI細胞系中，只有DLD1和HCT15不受WRN KD的影響（16）。事實上，WRN KD未能引起DLD1細胞的存活能力喪失和p53/PUMA表達。相反，通過同源重組將野生型p53插入（KI）到DLD1細胞中（34），完全恢復了p53和PUMA的誘導，細胞存活能力喪失以及WRN KD引起的caspase 9和3的活化。在p53-KI DLD1細胞中，PUMA KD通過siRNA抑制了WRN KD引起的caspase活化。類似地，將野生型p53轉染到HCT15細胞中，恢復了WRN KD引起的PUMA和凋亡的誘導。在CRISPR KO MLH1的p53突變型SW620細胞中，也觀察到了WRN KD未能誘導PUMA和凋亡的現(xiàn)象。

5.PUMA對WRN KD在MSI CRC腫瘤的體內治療效果至關重要

為了研究WRN在體內的作用，作者構建了穩(wěn)定的WT、PUMA-KO和CH3+5 HCT116細胞系，這些細胞系具有可誘導表達WRN小發(fā)夾RNA（Sh WRN）的強力霉素（Dox）誘導表達。預期地，通過Dox處理48小時以上，WRN的耗竭顯著誘導了兩個獨立的WT HCT116克隆中的p53和PUMA表達、半胱天冬酶活化以及存活率下降，但在PUMA-KO和CH3+5 HCT116細胞中沒有這種現(xiàn)象。然后，作者將這些細胞系植入裸鼠體內，建立異種移植瘤，并使用含有Dox的飲食誘導WRN的敲除。WRN敲除的誘導顯著抑制了WT而不是PUMA-KO和CH3+5 HCT116移植瘤的生長。由于WRN表達的恢復，腫瘤生長在后期時間點增加。WRN敲除對不同組的體重沒有影響。

6.WRN抑制劑通過p53/PUMA介導的凋亡在體外和體內抑制MSI結直腸癌的生長

為了探索WRN靶向作為治療微衛(wèi)星不穩(wěn)定結直腸癌的方法，作者首先測試了之前描述過的小分子WRN解旋酶抑制劑NSC617145（35）。6 μM的NSC617145可以選擇性地抑制HCT116親本細胞而不影響CH3+5細胞，這伴隨著p53/PUMA的誘導以及p53/PUMA依賴的細胞存活率下降和凋亡誘導。ML216最初被鑒定為Bloom (BLM)解旋酶的抑制劑，可以在IC50值分別為5和12.6 μM的條件下抑制全長WRN和缺乏N-末端外切酶結構域的截短衍生物（36）。盡管人類成纖維細胞在WRN基因表達正?；蛉笔У那闆r下對ML216同樣敏感（36），但該抑制劑尚未在微衛(wèi)星不穩(wěn)定型癌細胞系中進行過測試。在父細胞與CH3+5 HCT116細胞中，以8 μM的濃度處理ML216 72小時，但不是更高的濃度，導致細胞存活率下降更多，PUMA誘導和凋亡增加。

7.ML216抑制了MSI患者源自異種移植瘤（PDX）的腫瘤生長，并誘導了p53/PUMA以及細胞凋亡

為了探索WRN靶向治療MSI結直腸癌的轉化潛力，作者分析了ML216對PDX模型的抗腫瘤效果，這些模型比細胞系異種移植更好地重現(xiàn)了原始患者腫瘤的組織學、異質性和分子改變（37）。作者擴增并分析了三個來自國家癌癥研究所（NCI）的PDX模型，包括MSS PDX-S1模型和兩個MSI PDX-I1和PDX-I2模型，它們都攜帶MSH2和MSH6基因的突變和/或缺失。通過分析五個微衛(wèi)星標記物的貝塞斯達面板，驗證了這些PDX模型的MSS/MSI狀態(tài)。ML216治療顯著抑制了PDX-I1和PDX-I2腫瘤的生長，但對PDX-S1腫瘤沒有影響，同時沒有影響體重。

至此，這篇文章就介紹完啦，總結一下：作者首先詳細的探討了微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）與Werner (WRN)解旋酶的關系；第二部分描述了其在結腸癌細胞中如何強烈誘導p53及其下游的凋亡目標PUMA；第三部分介紹了WRN的消耗或使用RecQ解旋酶抑制劑ML216對MSI CRC的影響；第四部分敘述了p53/PUMA介導的凋亡在MSI CRC對WRN喪失的脆弱性中的關鍵作用，以及WRN作為治療靶點的前景。全篇知識點豐富，有很多值得作者深挖的生信分析的切入點，做結腸癌研究的小伙伴不要錯過啦！