結(jié)直腸癌（CRC）是世界范圍內(nèi)第三大致死癌癥，由于其侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差和缺乏靶向治療，因此發(fā)病率較高?；?-氟尿嘧啶（5-FU）的化療在CRC的治療中起了重要作用。然而，由于長(zhǎng)期使用5-FU會(huì)產(chǎn)生多藥耐藥性（MDR），從而嚴(yán)重削弱了治療效果[1, 2]。
   最近，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)癌癥耐藥株中miRNA在耐藥性方面起了重要作用，且藥物抗性的分子靶點(diǎn)和機(jī)制也被闡明[3, 4]，如miR-21可通過(guò)下調(diào)CRC中人類(lèi)DNA MutS homolog2（hMSH2）誘導(dǎo)對(duì)5-FU的耐藥性[5]。文獻(xiàn)進(jìn)一步報(bào)道，恢復(fù)失調(diào)的miRNAs可以有效克服耐藥性。因此，作者推測(cè)共傳遞MDR-reversing miRNA和化學(xué)治療藥物將是一種有望克服癌癥化療中MDR的有效方法。但是，安全有效的靶向給藥系統(tǒng)是CRC治療的關(guān)鍵。
   外泌體（exosomes）是由多泡體（MVB）與質(zhì)膜融合時(shí)釋放到細(xì)胞外環(huán)境的一種膜泡[6]，在不同細(xì)胞的外泌體中都可以檢測(cè)到mRNAs、miRNAs和蛋白質(zhì)的存在，以此挖掘外泌體介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的潛在機(jī)制。文獻(xiàn)報(bào)道了外泌體可以有效地傳遞生物藥物，且通過(guò)分子途徑可以靶向識(shí)別腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)藥物遞送[7]。但是利用外泌體進(jìn)行功能RNAs和化療藥物共遞送尚未被分析透徹，還需要進(jìn)一步研究。
   近期東南大學(xué)肖忠黨課題組通過(guò)對(duì)外泌體進(jìn)行改造，同時(shí)用外泌體共遞送5-FU和miR-21抑制劑（miR-21i）靶向結(jié)腸癌細(xì)胞，經(jīng)體外和體內(nèi)研究表明了用工程化外泌體遞送5-FU和miR-21i可有效逆轉(zhuǎn)耐藥性，并顯著增強(qiáng)了5-FU耐藥癌細(xì)胞的毒性[8]。

   和元生物可提供從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、外泌體分離、外泌體鑒定、外泌體高通量檢測(cè)、外泌體示蹤到體內(nèi)外功能驗(yàn)證的整體服務(wù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1.外泌體的分離和表征
   為了使外泌體具有靶向性，作者將Her2親合體與人Lamp2的胞外N端融合，根據(jù)以前的研究，Lamp2蛋白在外泌體膜中被大量發(fā)現(xiàn)。再將該融合結(jié)構(gòu)克隆到帶有GFP的慢病毒載體中，形成了THLG，另外一種不含Her2親合體的融合結(jié)構(gòu)，克隆后形成了LG，作為對(duì)照（Fig.1a）。隨后將THLG和LG轉(zhuǎn)染到HEK293T中，THLG-293T或LG-293T細(xì)胞的熒光顯微鏡圖片顯示，THLG和LG嵌合體蛋白存在于顆粒膜和質(zhì)膜中（Fig.1b）。從THLG-293T或LG-293T的培養(yǎng)上清中分別超離出外泌體（THLG-EXO 和LG-EXO），再用western對(duì)外泌體的標(biāo)志物如CD63、CD9、CD81進(jìn)行檢測(cè)（Fig.1c）。為了驗(yàn)證LAMP2融合蛋白是否結(jié)合到來(lái)自母細(xì)胞的外泌體中，作者用anti-GFP抗體和WB檢測(cè)了融合蛋白在母細(xì)胞和外泌體中的表達(dá)。如Fig.1c所示，融合蛋白（LG）的分子量大約在80kDa，而THLG融合蛋白略高于LG，這與糖基化LAMP2和GFP的分子大小之和一致。此外，結(jié)果顯示LG和THLG在HEK293T中均有高表達(dá)，并能整合到外泌體中。相比之下，在轉(zhuǎn)染GFP的HEK293T細(xì)胞的外泌體中沒(méi)有檢測(cè)到GFP的水平，說(shuō)明細(xì)胞質(zhì)中的GFP可能沒(méi)有整合到外泌體（Fig.1d）。此外，上述結(jié)果證明了含有GFP的融合蛋白存在于外泌體中，并對(duì)THLG-EXO和LG-EXO進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示可以在激光掃描共聚焦纖維鏡下觀察到GFP。這一結(jié)果進(jìn)一步表明了融合蛋白成功地整合到外泌體中（Fig.1e）。
   然后利用透射電鏡（TEM）和動(dòng)態(tài)激光散射光譜（DLS）對(duì)外泌體的形態(tài)和大小進(jìn)行了評(píng)價(jià)。其中，THLG-EXO具有典型的碟狀雙層膜結(jié)構(gòu)，直徑為60-130nm（Fig.1f）。DLS結(jié)果顯示外泌體的大小分布較窄，平均直徑為97nm，而THLG-EXO在裝載了5-Fu/miR-21i后大小為110nm（Fig.1g）。

2.含miR?21i和5?FU外泌體的制備
   接下來(lái)，作者評(píng)估了THLG-EXO作為共遞送5-FU和miR?21i的載體的可行性。之前的一些結(jié)果表明，使用電穿孔可以有效地將化療藥物和外源短RNAs引入EVs。在本次研究中，作者也使用了電穿孔的方法將miR?21i和5?FU裝載入外泌體中。為了獲得最佳的電穿孔參數(shù)，作者測(cè)試了不同的電壓和脈沖長(zhǎng)度對(duì)電穿孔效率的影響。結(jié)果表明，當(dāng)時(shí)間常數(shù)為10ms，電壓為1000V時(shí)，裝載效率最高。電穿孔后，THLG-EXO/5-FU/miR-21i的體積在miR-21i和5-FU負(fù)載的外泌體的形態(tài)上顯示出一些細(xì)微的差異，包括略大的平均直徑（110±11.3nm）(Fig. 1f, g)和表面電位（11±2.7mV）。而TEM照片顯示THLG-EXO的平均直徑為97±6.2 nm，表面電位為?8±2.4 mV。關(guān)于這些變化，作者推測(cè)這是在外泌體中電穿孔miR-21i和5-FU的結(jié)果，因?yàn)樗杏糜诋a(chǎn)生外泌體的其他程序都是相同的。在最佳電穿孔條件下，HPLC和qRT-PCR結(jié)果表明，外泌體的5-FU和miR-21i負(fù)載量（LC）分別約為3.1%和0.5%。
3.THLG-EXO的體外靶向性
為了分析THLG-EXO在體外的潛在靶向能力，作者建立了Her2陰性的SGC-7901 WT細(xì)胞和Her陽(yáng)性的Her2-mcherry-SGC-7901細(xì)胞共培養(yǎng)模型并進(jìn)行了評(píng)價(jià)(Fig. 2a)。熒光顯微鏡結(jié)果顯示，與SGC-7901 WT細(xì)胞相比，THLG-EXO與Her2-mcherry-SGC-7901細(xì)胞共培養(yǎng)3h后，THLG-EXO能更有效地進(jìn)入Her2-mcherry-SGC-7901細(xì)胞。相比之下，LG-EXO在Her2-mcherry-SGC-7901細(xì)胞中沒(méi)有表現(xiàn)出這種特異性的定位，且在共培養(yǎng)模型中隨機(jī)分布(Fig. 2b)。此外，利用流式細(xì)胞儀定量分析了THLG-EXO的細(xì)胞攝取情況。圖Fig. 2c所示，與THLG-EXO共培養(yǎng)3h后，GFP陽(yáng)性的Her2-mcherry-SGC-7901細(xì)胞增加了92.9%，而SGC-7901細(xì)胞則為18.6%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。相比之下，與LG-EXO共培養(yǎng)3h后，GFP陽(yáng)性的Her2-mcherry-SGC-7901細(xì)胞百分比僅增長(zhǎng)了1.4%，而SGC-7901細(xì)胞比例為1.2%。這些結(jié)果表明使用T-Her2作為Her2的配體可以顯著地增強(qiáng)外泌體靶向細(xì)胞的能力。

4.THLG?EXO/5?FU/miR?21i的體外抗腫瘤作用
   上述結(jié)果表明，工程化外泌體能有效地被受體細(xì)胞吸收。隨后，作者研究了包裹了miR-21i和5-FU的THLG?EXO誘導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)以及miR-21i和5-FU對(duì)5-FU耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞系的協(xié)同細(xì)胞毒性。HCT-116的5-FU耐藥株是在5-FU濃度逐漸增加的情況下，由這些細(xì)胞連續(xù)傳代產(chǎn)生的。首先，作者研究了THLG?EXO/5?FU/miR?21i傳遞寡核苷酸進(jìn)入靶細(xì)胞的能力。如Fig.3a所示，HCT-116^5FR與THLG?EXO/miR?21i共孵育6h后，其內(nèi)源性miR-21水平顯著降低，而與游離的miR?21i共孵育后并沒(méi)有出現(xiàn)這種情況，說(shuō)明與游離的miR-21i共孵育后并沒(méi)有寡核苷酸進(jìn)入HCT-116^5FR細(xì)胞。為了進(jìn)一步證實(shí)THLG?EXO/5?FU/miR?21i中miR?21i在HCT-116^5FR細(xì)胞中誘導(dǎo)的生物學(xué)功能，作者評(píng)估了miR-21下游靶基因的表達(dá)水平，如hMSH2和PTEN。如所預(yù)期的，與THLG-EXO處理的細(xì)胞相比，HCT-116^5FR細(xì)胞用THLG-EXO/5-FU/miR-21i處理后，hMSH2和PTEN的蛋白表達(dá)水平增加（Fig.3b）。這些結(jié)果表明THLG?EXO/5?FU/miR?21i可以有效地將miR-21i傳遞到受體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，且能特異性地沉默受體細(xì)胞中miR-21的生物學(xué)功能。
   接下來(lái)，為了評(píng)估THLG?EXO介導(dǎo)的5-FU和miR-21i共遞送的協(xié)同抗腫瘤效果，作者研究了5-FU濃度為5ug/ml時(shí)HCT-116^5FR細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞周期和增殖情況。如Fig.3c所示，與裝載了miR-21i或5-FU的THLG?EXO共孵育后，HCT-116^5FR細(xì)胞的凋亡率分別達(dá)到12.6%和26.2%。顯然，與mock-THLG-EXO處理組相比，只遞送miR-21i并不能達(dá)到理想的治療效果。相比之下，THLG-EXO介導(dǎo)的5-FU和miR-21i共遞送引起的細(xì)胞凋亡率（凋亡率約42.3%）要高于THLG-EXO/5-FU處理的細(xì)胞組（凋亡率約26.2%），這說(shuō)明了協(xié)同效果對(duì)靶細(xì)胞的凋亡影響最強(qiáng)。
   隨后，通過(guò)PI對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示，與THLG?EXO相比，THLG?EXO/5?FU/miR?21i對(duì)HCT-1165FR細(xì)胞的S期阻斷顯著，而THLG?EXO/miR?21i對(duì)HCT-116^5FR細(xì)胞周期分布沒(méi)有明顯的影響（Fig.3d）。值得注意的是，與THLG?EXO相比，THLG?EXO/5?FU/miR?21i對(duì)HCT-116^5FR細(xì)胞的G1期也有一定程度的影響，但是這種效果沒(méi)有對(duì)S期明顯。此外，作者還分析了THLG?EXO/miR?21i、THLG?EXO/5?FU、THLG?EXO/5?FU/miR?21i抑制癌細(xì)胞增殖的能力。結(jié)果顯示，這三種外泌體都可以抑制細(xì)胞的增殖，但是隨時(shí)時(shí)間的推移，它們對(duì)細(xì)胞增殖的影響有明顯的差異。如Fig.3e所示，與THLG?EXO/miR?21i、THLG?EXO/5?FU、THLG?EXO/5?FU/miR?21i共培養(yǎng)6天后，細(xì)胞增殖分別被抑制了約12%、43%和82%。這個(gè)結(jié)果表明，雖然THLG?EXO/5?FU具有較強(qiáng)的抑制生長(zhǎng)的作用，但是THLG?EXO/5?FU/miR?21i對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用更強(qiáng)，幾乎完全抑制了細(xì)胞的增殖。而用THLG?EXO/miR?21i處理的細(xì)胞增殖略有下降。這與作者在細(xì)胞周期阻斷和凋亡結(jié)果上的發(fā)現(xiàn)一致。因此，研究結(jié)果揭示了miR?21i可以提高HCT-116^5FR細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性，并且與單藥劑治療相比，5-FU與miR-21i聯(lián)合治療可以顯著提高5-FU對(duì)HCT-116^5FR細(xì)胞的抗腫瘤作用。

5.THLG?EXO在體內(nèi)的分布情況
   THLG?EXO介導(dǎo)的miR?21i和5?FU對(duì)Her2陽(yáng)性癌細(xì)胞的共遞送已顯示理想的體外遞送效果。隨后，作者用體內(nèi)成像系統(tǒng)評(píng)估其體內(nèi)遞送效率。為了闡述體內(nèi)靶向腫瘤的能力，作者在BALB/c雌性裸鼠的皮下接種了HCT-1165FR細(xì)胞。之后，用DiR染料標(biāo)記THLG?EXO和LG?EXO，經(jīng)尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)。在不同的時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)注射的外泌體的生物分布情況。如Fig.4所示，在注射后的最早時(shí)間點(diǎn)（30min），THLG?EXO和LG?EXO迅速分布全身，不同的是，THLG?EXO在腫瘤內(nèi)分布比較多，說(shuō)明THLG?EXO在腫瘤區(qū)域內(nèi)能快速積累，而LG?EXO主要分布在肝臟，這表明了LG?EXO吸收和保留主要發(fā)生在肝臟和其他代謝器官，沒(méi)有在腫瘤區(qū)域積累。此外，隨著時(shí)間的推移，在這兩組之間發(fā)現(xiàn)了顯著的差異。在注射THLG?EXO 3小時(shí)后，腫瘤區(qū)域能檢測(cè)到較強(qiáng)的熒光信號(hào)，而小鼠身體其他部位的英冠光信號(hào)逐漸減弱。此外，在注射LG?EXO 6小時(shí)后，足部和頸部仍可檢測(cè)到相對(duì)強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。相比之下，THLG?EXO組在這些部位沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)，而熒光信號(hào)僅在腫瘤部位檢測(cè)到了。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明THLG?EXO可以作為靶向Her2表達(dá)腫瘤細(xì)胞的有效藥物載體。

6.THLG?EXO/5?FU/miR?21i的體內(nèi)抗腫瘤作用
   體外實(shí)驗(yàn)顯示THLG?EXO具有高效靶向腫瘤細(xì)胞給藥的能力，以及miRNA調(diào)控與5-FU治療的協(xié)同作用，隨后作者也在體內(nèi)用這種多組合方法評(píng)估是否能增強(qiáng)抗腫瘤作用。作者將HCT-1165FR-Luc誘導(dǎo)的腫瘤雌性裸鼠隨機(jī)分成四組并給予注射藥物制劑，包括THLG?EXO/5?FU/miR?21i、THLG?EXO/5?FU、THLG?EXO/miR?21i及THLG?EXO對(duì)照組。作者用腫瘤部位的生物熒光強(qiáng)度估計(jì)腫瘤大小。與預(yù)期一樣，THLG-EXO/5-FU/miR-21i組效果最佳，即腫瘤體積隨時(shí)間顯著縮小。如Fig.5a所示，其他的治療仍有不同程度的腫瘤擴(kuò)大，尤其是THLG-EXO組，惡性腫瘤轉(zhuǎn)移比較明顯。通過(guò)測(cè)量相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度，定量各組小鼠的平均發(fā)光強(qiáng)度（BLI）（Fig.5b）。在研究結(jié)束時(shí)，處死小鼠，切除腫瘤并稱重。如Fig.5c所示，顯然，與注射THLG-EXO和THLG-EXO/5-FU的小鼠相比，注射THLG-EXO/5-FU/miR-21i的小鼠腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，腫瘤重量下降。
   為了進(jìn)一步評(píng)估不同外泌體在腫瘤中誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡情況，作者采用TdTdUTP標(biāo)記（TUNEL）染色分析細(xì)胞凋亡。如Fig.5d所示，靜脈注射THLG-EXO/5-FU或THLG-EXO/5-FU/miR-21i后，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，其中THLG-EXO/5-FU/miR-21i組尤為明顯。靜脈注射THLG-EXO/miR-21i后，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)略有增加，表明了僅使用miR-21i對(duì)細(xì)胞凋亡影響不大。然而，工程化外泌體同時(shí)結(jié)合miR-21i和5-FU可以得到非常顯著的抗腫瘤作用。隨后，作者通過(guò)WB檢測(cè)了外泌體傳遞的miR-21i的基因調(diào)控活性。如Fig.5e所示，THLG-EXO/miR-21i和THLG-EXO/5-FU/miR-21i能提升腫瘤組織中hMSH2和PTEN的蛋白表達(dá)，而THLG-EXO單獨(dú)遞送5-FU對(duì)hMSH2和PTEN的表達(dá)幾乎沒(méi)有明顯的影響。這些體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與細(xì)胞內(nèi)的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈正相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)THLG-EXO介導(dǎo)5-FU和miR-21i共遞送，對(duì)腫瘤的作用效果最好。

7.體內(nèi)的安全性評(píng)估
   除了治療效果，毒性是一個(gè)優(yōu)良載體進(jìn)一步使用需要考慮的另一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。出于安全考慮，作者每隔一天靜脈注射20mg/kg 劑量的THLG-EXO，持續(xù)一周后評(píng)估THLG-EXO是否對(duì)健康BALB/c小鼠的全身系統(tǒng)產(chǎn)生毒性。與PBS組相比，實(shí)驗(yàn)組在研究期間沒(méi)有觀察到小鼠的死亡和嚴(yán)重的體重下降（數(shù)據(jù)未顯示）。眾所周知，經(jīng)靜脈注射的納米級(jí)脂泡大部分被單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（MPS）吸收和清除。因此，作者進(jìn)一步研究了外泌體對(duì)這些器官誘發(fā)的潛在病理?yè)p傷。用血液生化和血液學(xué)分析外泌體對(duì)處理小鼠的任何潛在毒性作用。作者檢測(cè)了不同生化指標(biāo)，包括肝功能指標(biāo)如谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST），腎功能指標(biāo)如肌酐（CRE）、血尿素氮（BUN）。從表1中可以看出，上述各項(xiàng)指標(biāo)均與PBS處理組相同，說(shuō)明THLG-EXO在給藥方案中沒(méi)有明顯的肝或腎毒性。血液學(xué)檢查包括白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）和血小板計(jì)數(shù)。上述參數(shù)中THLG-EXO處理組與PBS組比較均無(wú)顯著性差異（Table 1）。此外，如Fig.6所示，在THLG-EXO處理組中心臟、肝臟、脾臟、肺、腎等主要組織未見(jiàn)明顯的組織病理學(xué)異常或病變，這說(shuō)明了THLG-EXO沒(méi)有引起炎癥反應(yīng)。這些結(jié)果表明，THLG-EXO多次給藥對(duì)小鼠血液系統(tǒng)和主要器官不會(huì)引起急性毒性。

Table 1 THLG-EXO處理組小鼠的臨床化學(xué)和血液學(xué)參數(shù)

結(jié)論：
   在本篇研究中，作者成功開(kāi)發(fā)了一種聯(lián)合策略，利用工程化外泌體的傳遞系統(tǒng)，同時(shí)將miR-21i和化療藥物5-FU傳遞給HCT-1165FR癌細(xì)胞，有效逆轉(zhuǎn)了耐藥性，提高了腫瘤治療的作用。
   和元生物一直致力為外泌體研究提供整體解決方案，從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、外泌體分離、外泌體鑒定、外泌體分子檢測(cè)到外泌體示蹤和體內(nèi)外功能驗(yàn)證，豐富的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)、專業(yè)的科研團(tuán)隊(duì)、優(yōu)質(zhì)的技術(shù)支持服務(wù)，為您的項(xiàng)目保駕護(hù)航！

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