《生物技術制藥》試卷

一、填空（每空1分，共計20分）

1．Klenow酶的活性有：  5’ → 3’ 聚合酶活性     ，  3’ → 5’ 外切酶活性     。

2．克隆抗生素生物合成基因的策略有：   阻斷變株法      ，突變克隆法         ，

在標準宿主菌中克隆檢測單基因產(chǎn)物， 直接克隆法    ， 克隆抗性基因法      ，

寡核苷酸探針法          ，  同源基因雜交法       。

3．人工化學合成DNA新形成的核苷酸鏈的合成方向是    3’ → 5’         ，合成的

DNA 5’末端是    -OH     ，3’ 末端是    -OH     。

4．一個理想的載體應具備的條件是： 至少有一個復制起點  ，   有克隆位點       ，

具備轉化的功能       ，    遺傳標記基因        ，  具有較高的載裝能力 。

5．進行PCR擴增DNA時，反應體系應加入模板DNA，   Taq 酶                ，

一對引物              ， dNTP   或   緩沖液   。

二、選擇題（每題2分，共計30分）

1．基因工程的單元操作順序是（  A  ）

Ａ．酶切，連接，轉化，篩選，驗證    Ｂ．酶切，轉化，連接，篩選，驗證

Ｃ．連接，轉化，篩選，驗證，酶切    Ｄ．驗證，酶切，連接，篩選，轉化

Ｅ．酶切，連接，篩選，轉化，驗證

2．下列五個 DNA 片段中含有回文結構的是（   D、E  ）   
    Ａ．GAAACTGCTTTGAC                  Ｂ．GAAACTGGAAACTG
    Ｃ．GAAACTGGTCAAAG                  Ｄ．GAAACTGCAGTTTC
    Ｅ．GAAACTGCAGAAAG

3．T 4 -DNA 連接酶是通過形成磷酸二酯鍵將兩段 DNA 片段連接在一起，其底物的關鍵基團是（  D  ）
   Ａ．2' -OH 和 5' -P                 Ｂ．2' -OH 和 3' -P
   Ｃ．3' -OH 和 2' -P                 Ｄ．3' -OH 和 5' -P
   Ｅ．5' -OH 和 3' -P

4．l-DNA 體外包裝的上下限是天然l-DNA 長度的（ D  ）
   Ａ．25 - 50 %                       Ｂ．50 - 100 %
   Ｃ．75 - 100 %                      Ｄ．75 - 105 %
   Ｅ．100 - 125 %

5．下列各常用載體的裝載量排列順序，正確的是（ A  ）
   Ａ．Cosmid > l-DNA > Plasmid   Ｂ．l-DNA > Cosmid > Plasmid
   Ｃ．Plasmid > l-DNA > Cosmid   Ｄ．Cosmid > Plasmid > l-DNA
   Ｅ．l-DNA > Plasmid > Cosmid

6．某一重組質粒 （7.5 kb）的載體部分有2個SmaI酶切位點。用SmaI酶切后凝膠電泳上出現(xiàn)4條長度不同的條帶，其長度總和與已知數(shù)據(jù)吻合，該重組質粒中插入的外源DNA片段上的SmaI酶切位點共有（  D   ）
   Ａ．5 個                        Ｂ．4 個
   Ｃ．3 個                        Ｄ．2 個         Ｅ．至少 2 個

7．若某質粒帶有 lacZ 標記基因，那么與之相匹配的篩選方法是在篩選培養(yǎng)基中加入(   D、E  )                            
   Ａ．半乳糖             Ｂ．葡萄糖                Ｃ．蔗糖
   Ｄ．5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷（X-gal）
   Ｅ．異丙基巰基-b-半乳糖苷（IPTG）

8．分子雜交的化學原理是形成（ E  ）
   Ａ．共價鍵                      Ｂ．離子鍵
   Ｃ．疏水鍵                      Ｄ．配位鍵          Ｅ．氫鍵

9．促紅細胞生長素（ EPO ）基因能在大腸桿菌中表達，但卻不能用大腸桿菌的基因工程菌生產(chǎn)人的促紅細胞生長素，這是因為（  E  ） 
    Ａ．人的促紅細胞生長素對大腸桿菌有毒性作用
    Ｂ．人的促紅細胞生長素基因在大腸桿菌中極不穩(wěn)定
    Ｃ．大腸桿菌內毒素與人的促紅細胞生長素特異性結合并使其滅活
    Ｄ．人的促紅細胞生長素對大腸桿菌蛋白水解酶極為敏感
    Ｅ．大腸桿菌不能使人的促紅細胞生長素糖基化

10．鳥槍法克隆目的基因的戰(zhàn)略適用于（   A   ）
    Ａ．原核細菌                   Ｂ．酵母菌
    Ｃ．絲狀真菌                   Ｄ．植物           Ｅ．人類

11．cDNA第一鏈合成所需的引物是（ D ）
    Ａ．Poly A                     Ｂ．Poly C 
    Ｃ．Poly G                     Ｄ．Poly T         Ｅ．發(fā)夾結構

12．cDNA法獲得目的基因的優(yōu)點是（   B  ）
    Ａ．成功率高                   Ｂ．不含內含子
    Ｃ．操作簡便                   Ｄ．表達產(chǎn)物可以分泌     Ｅ．能糾正密碼子的偏愛性

13．人工合成 DNA 的單元操作包括（   E    ）
I 去保護  II 偶聯(lián)  III 封端  IV 氧化 
    Ａ．I + II                     Ｂ．II + IV
    Ｃ．I + II + III               Ｄ．II + III + IV        Ｅ．I + II + III + IV

14．為了減輕工程菌的代謝負荷，提高外源基因的表達水平，可以采取的措施有（ A、C ）

A．將宿主細胞生長和外源基因的表達分成兩個階段。

B．在宿主細胞快速生長的同時誘導基因表達。

C．當宿主細胞快速生長時抑制重組質粒的復制。

D．當宿主細胞快速生長時誘導重組質粒的復制

15．菌體生長所需能量（ A  ）菌體有氧代謝所能提供的能量時，菌體往往會產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物乙酸。

A．大于                        B．等于

C．小于

三、問答題（共計50分）

1．基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的兩種主要表現(xiàn)形式是什么？基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性

的主要機制是什么？（10分）

基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式：

1．結構不穩(wěn)定性：重組 DNA 分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導致其表觀生

物學功能的喪失

2．分配不穩(wěn)定性：整個重組 DNA 分子從受體細胞中逃逸。

基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的的產(chǎn)生機制

1．受體細胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組 DNA 分子的降解

2．外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝

3．重組質粒在受體細胞分裂時的不均勻分配，這是重組質粒逃逸的基本原因

4．受體細胞中內源性的轉座元件促進重組分子的缺失重排

2．在人胰島素AB鏈分別表達法中，為何將AB鏈編碼序列與b-半乳糖苷酶基因融合？（10分）

小分子蛋白在大腸桿菌中表達后不穩(wěn)定，容易被細胞內蛋白酶降解失活。表達融合蛋白的優(yōu)點是基因操作簡便；在菌體內比較穩(wěn)定，不易被細菌酶類所降解，容易實現(xiàn)高效表達。人胰島素AB鏈分別表達法中，將A、B鏈編碼序列與b-半乳糖苷酶基因融合，分別表達出融合蛋白，使表達的蛋白分子量足夠大，避免被蛋白水解酶分解，提高其穩(wěn)定性及表達率。

3．動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法有哪些？各自的特點是什么？（10分）

1．懸浮培養(yǎng)

懸浮培養(yǎng)即讓細胞自由地懸浮于培養(yǎng)基內生長增殖。它適用于一切種類的非貼壁依賴性細胞（懸浮細胞），也適用于兼性貼壁細胞。該培養(yǎng)方法的優(yōu)點是操作簡便，培養(yǎng)條件比較均一，傳質和傳氧較好，容易擴大培養(yǎng)規(guī)模，在培養(yǎng)設備的設計和實際操作中可借鑒許多有關細菌發(fā)酵的經(jīng)驗。不足之處是由于細胞體積較小，較難采用灌流培養(yǎng)（perfusion culture )，因此細胞密度一般較低。

2．貼壁培養(yǎng)

貼壁培養(yǎng)是必須讓細胞貼附在某種基質上生長繁殖的培養(yǎng)方法。它適用于一切貼附依賴性細胞（貼壁細胞），也適用于兼性貼壁細胞。該方法的優(yōu)缺點與懸浮培養(yǎng)正好相反，優(yōu)點是適用的細胞種類廣（因為生產(chǎn)中所使用的細胞絕大多數(shù)是貼壁細胞），較容易采用灌流培養(yǎng)的方式使細胞達到高密度；不足之處是操作比較麻煩，需要合適的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不易均一，傳質和傳氧較差。

3．貼壁—懸浮培養(yǎng)

微載體培養(yǎng)既可創(chuàng)造相當大的貼附面積供細胞貼附生長增殖，滿足了絕大多數(shù)細胞的基本要求，又由于載體的體積很小，比重較輕，在輕度攪拌下即可攜帶細胞自由地懸浮在培養(yǎng)基內，充分發(fā)揮了懸浮培養(yǎng)的一切優(yōu)點。

4. 闡述基因工程藥物研制有那些主要過程（10分）

基因工程藥物的生產(chǎn)必須首先獲得目的基因，然后用限制性內切酶和連接酶將所需目的基因插入適當?shù)妮d體質粒或噬菌體中并轉入大腸桿菌或其他宿主菌（細胞），以便大量復制目的基因。對目的基因要進行限制性內切酶和核苷酸序列分析。

目的基因獲得后，最重要的就是使目的基因表達?；虻谋磉_系統(tǒng)有原核生物系統(tǒng)和真核生物化的難易。將目的基因與表達載體重組，轉入合適表達系統(tǒng)，獲得穩(wěn)定高效表達的基因工程菌（細胞）。

建立適于目的基因高效表達的發(fā)酵工藝，以便獲得較高產(chǎn)量的目的基因表達產(chǎn)物。

建立起一系列相應的分離純化、質量控制、產(chǎn)品保存等技術。     

5．闡述鼠源性單克隆抗體改造后的小分子抗體類型（10分）

（1）人－鼠嵌合抗體

將鼠MAb的可變區(qū)和人抗體的恒定區(qū)組成嵌合抗體由于這兩部分在空間結構上相對獨

立，其獨特的抗體親和力保持得很好，但因鼠單抗可變區(qū)的存在，應用時仍有較強的排斥反應。

（2）改形抗體

在嵌合抗體的基礎上進一步將鼠MAb可變區(qū)中相對保守的FR替換成人的FR，保留與抗原結合的CDR部位

（3）Fab抗體

Fab段由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與整個輕鏈以二硫鍵形式連接而成，主要發(fā)揮抗體的抗原結合功能。Fab抗體只有完整IgG的1/3。

（4）單鏈抗體

單鏈抗體(Single chain Fv，scFv)是由一段彈性連接肽(Linker)把抗體可變區(qū)重鏈(VH)與輕鏈(VL)相連而成，是具有親代抗體全部抗原結合特異性的最小功能結構單位。

（5）單域抗體

只含V區(qū)基因片段的小分子抗體，即只有VH或 VL一個功能結構域，也能保持原單克隆抗體的特異性。這種小分子的抗體片段就稱為單域或單區(qū)抗體，其分子量僅為整個Ig分子的1／12。

（6）分子識別單位

只含有一個CDR多肽的抗體。