我們實驗室有計劃做一些小肽的電泳檢測，目前是查閱文獻階段還未正式實驗，現(xiàn)將看到的一篇可行的文獻整理過來，方便大家查閱，文獻作者為暨南大學(xué)生殖免疫研究中心曹佐武教授。文章最后附上我們買的小肽Marker說明書，供大家參考。

聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDS-PAGE) 是分離蛋白質(zhì)的常用方法，樣品的蛋白質(zhì)分子熱變性解聚后與 SDS 結(jié)合形成帶負電的蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物，復(fù)合物在電泳中的遷移率取決于蛋白質(zhì)的分子大小，使用均勻濃度的 SDS- PAGE 來分析分子量在 15~ 200 kDa 的蛋白質(zhì)時，電泳遷移率與分子量的對數(shù)成線性關(guān)系，但分離分子量小于 10 kDa 的多肽效果差。

國外曾經(jīng)報道了分離小分子肽的三羥甲基氨基甘氨酸(Tricine )-SDS- PAGE 方法，該方法可分離分子量在1~ 100 kDa 的蛋白質(zhì)。十多年來，一直利用這種較簡便的不連續(xù)梯度膠分離小分子肽，國內(nèi)也有一些利用該方法的報道。但暨南大學(xué)生殖免疫研究中心曹佐武教授在用該系統(tǒng)分離小分子肽的實驗中發(fā)現(xiàn)，該方法分離大于2 kDa 的蛋白質(zhì)效果尚可， 但分離小至 1 kDa 的小分子時效果并不理想，表現(xiàn)為帶型彌散。通過改進，曹佐武教授建立了一種效果理想的分離小至 1 kDa 的小肽的方法。

1 材料和方法

1.1 器材

尿素( promega)，巰基乙醇(E.Merck， Darmstadt) ，過硫酸銨(AP)(Sigma，USA)， TEMED (Sigma ，USA) ，丙烯酰胺(Sigma)，甲叉雙丙烯酰胺(Sigma)，Tris堿(Serva)，SDS(Amresco)。    

低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(上海生物化學(xué)研究所)，特低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品C6210(Sigma)，胰島素(Sigma)。蛋白質(zhì)微量電泳儀(Bio-Rad Lab，USA)，Mini protein II垂直電泳槽(Bio-Rad Lab ，USA)，凝膠成像儀(Bio-Rad)。

1.2 溶液配制

1.2.1 Tricine-SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳溶液準(zhǔn)備

(1)正極緩沖液(10x) 121.14 g Tris 溶于400 mL 重蒸水，用1.0 mol/L HCl 調(diào)至pH 8.9，定容至500 mL。

(2)負極緩沖液(10 x) 將60.55 g Tris ，89.58 g Tricine 及5 g SDS溶于400 mL 重蒸水中，加水至終體積為500 mL。

(3)凝膠緩沖液(3x)將181.5 g Tris ，1.5 g SDS溶于 400 mL 重蒸水中，用1mol/L HCl滴定至 pH 8.45，再加水稀釋至500 mL 。

1.2.2 丙烯酰胺儲存液配制

(1) 3C丙烯酰胺儲存液將48 g丙烯酰胺和1.5 g甲叉雙丙烯酰胺溶于重蒸水中至100 mL。

(2) 5C丙烯酰胺儲存液用重蒸水溶解47 g丙烯酰胺和 2.5 g甲叉雙丙烯酰胺成100 mL 溶液。

(3) 6C丙烯酰胺儲存液用重蒸水溶解46.5 g丙烯酰胺和3.0 g甲叉雙丙烯酰胺成100 mL 溶液。

1.2.3 樣品與樣品緩沖液樣品緩沖液由4% SDS、12%甘油、50mmol/L Tris、2 %巰基乙醇(v/v)，及少許溴酚藍組成，pH 6.8。

低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品含有97.4 kDa、66.2k Da、43.0 kDa、31.0 kDa、20.1 kDa、14.4 kDa等6種成分，再補加3.5 kDa的胰島素肽，與樣品等體積混合，上樣前沸水浴5 min ，每次點樣量10μL。特低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(SigmaC6210)，每次點樣 10μL。    

2 實驗方法

2.1 不同組成的丙烯酰胺溶液的配制

Tricine-SDS PAGE 的凝膠由不同分子組成的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺混合液聚合而成。其中濃縮膠由 3C丙烯酰胺儲存液配成4%的丙烯酰胺溶液聚合而成，夾層膠由3C丙烯酰胺儲存液配成10%的丙烯酰胺溶液聚合而成，致密膠由 5C 丙烯酰胺儲存液或6C丙烯酰胺儲存液配成16.5%的丙烯酰胺溶液(添加或不添加36.5%尿素)聚合而成。凝膠配方見表1。

2.2 灌膠

凝膠制作采用三層不連續(xù)膠的結(jié)構(gòu)，由致密膠+夾層膠+濃縮膠構(gòu)成。灌膠前，各種丙烯酰胺溶液分別加入10μL 的過硫酸氨和1μL 的TEMED，隨即灌膠，先灌下層的致密膠，再覆蓋以中間的夾層膠，然后鋪濃縮膠。靜置以聚合形成三明治式的不連續(xù)梯度凝膠。

2.3 點樣

取 10μL 的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，煮沸 5 min 使蛋白質(zhì)與 SDS 結(jié)合變性，小心點入凝膠的點樣孔中。

2.4 電泳    

內(nèi)槽加入負極電泳緩沖液，外槽加入正極電泳緩沖液，形成 Trcine-SDS-PAGE 電泳系統(tǒng)，用20 mA恒流電泳 3 h?？捡R斯亮蘭染色后，用甘油溶液孵育，并用凝膠成像儀成像。

3 實驗結(jié)果

3 種分離膠用于分離低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品和特低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的電泳結(jié)果見圖1.其中圖1A為由"6C+U'致密膠和夾層膠組成的分離膠的電泳結(jié)果:圖IB為"5C +U'致密膠和夾層膠組成的分離膠的電泳結(jié)果:圖1C為由“5C致密膠和夾層膠組成的分離膠的電泳結(jié)果，

圖1A 顯示用"6C+尿素"凝膠電泳可清晰地分離低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品中的7條帶，也基本可分離出特低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品中的6條帶，但1kDa小分子的帶型彌散，而第3條帶自身顯示紅色，且與第2條帶的分子量接近，因而帶型效果差。圖1B能很清晰地顯示低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品中的7條帶和特低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品中的6條帶，特別是1kDa小分子的帶型也很清晰。圖1C能顯示低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品中的7條帶，但是只分離出特低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品中的5條帶.1kDa小分子未見明顯的帶型?？梢?，"5C+尿素"凝膠分離小分子蛋白的電泳效果最好，尤其是 1kDa帶很清晰。    

4討論

常規(guī)聚丙烯酰胺電泳方法分離 10 kDa以下的小肽效果差。傳統(tǒng)上分離小分子肽用連續(xù)梯度膠，制作較麻煩，而且需要專門的灌膠設(shè)備。Schagger 等改用Tricine-SDS-PAGE系統(tǒng)后，對小分子肽的分辨率明顯提高。利用16.5%凝膠濃度、11 %甘油，按"小孔膠+夾層膠+濃縮膠”模式制作不連續(xù)的梯度膠，分析昆蟲細胞的表達產(chǎn)物，可見小于 14 kDa 的幾個小分子成分，并呈現(xiàn)清晰的3-4條帶，而且還能分離2-3 kDa的肽段。利用"6C +U”配方配制的凝膠能分離小至 1 kDa的肽段，多年來國內(nèi)分離小分子肽一直沿用這種方法，沒有實質(zhì)的改進。但是，作者發(fā)現(xiàn)，利用這種凝膠在Tricine-SDS-PAGE系統(tǒng)中雖能分離小至 1kDa 的肽段，但效果不理想，主要表現(xiàn)為小分子成分形成的帶型彌散，如圖1A的泳道2所示。

經(jīng)過幾年的摸索，作者發(fā)現(xiàn)，調(diào)整聚丙烯酰胺凝膠的分子組成后，可以改善分離小分子肽的效果。本文采用“5C +U”丙烯酰胺溶液配成的聚丙烯酰胺凝膠，使丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的交聯(lián)度為 5.05%，分離特小分子量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 C6210，可見清晰的6條帶，而且1 kDa的小肽的帶型也非常清晰(如圖1B的泳道2所示)，明顯優(yōu)于“6C +U’凝膠的分離效果?？梢姡{(diào)整凝膠中丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的分子比例可直接影響凝膠的分離效果，這可能是由于二者的比例影響凝膠的分子間隙。有報道認為，當(dāng)凝膠中丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的分子比例為20/1 時，分子間隙最小。本文調(diào)整分子比例后，膠中丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的分子比例接近 20/1，使凝膠分子結(jié)構(gòu)更致密，更有利于小分子肽的分離。但是，即使凝膠中丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的分子的交聯(lián)度接近1/20，單憑這2種分子本身組成的凝膠還不能分離小至1 kDa 的肽段，該凝膠分離特小分子量的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，僅分辨出5條帶，沒有顯示出 1 kDa 的肽段(如圖1C)所示。加入尿素后的凝膠能清晰地顯示1 kDa 的帶型?？梢姡蛩啬茉鰪姺蛛x效果。    

相關(guān)問答：

1.Tricine-SDS-PAGE與傳統(tǒng)SDS-PAGE的區(qū)別：

(1)分離膠中更高的Tris濃度：終濃度為0.75M；普通SDS-PAGE為0.375M

(2)分離膠和濃縮膠中的pH都是8.45

(3)分離膠中更高的交聯(lián)度（C）-5%，普通的SDS-PAGE為C一般為3.3%。

小肽的電泳：

2.關(guān)于陰極緩沖液和陽極緩沖液：

Tricine-SDS-PAGE系統(tǒng)不同于常規(guī)的SDS-PAGE，使用兩種緩沖液電泳。電泳槽內(nèi)槽是1×陰極緩沖液，含有Tricine和SDS。外槽是1×陽極緩沖液，是0.2M Tris。由于電泳槽內(nèi)外槽緩沖液不一樣，電泳前要檢測電泳槽是否漏液，如果漏液的話將導(dǎo)致內(nèi)外槽緩沖液混合，導(dǎo)致電泳結(jié)果不好。如果發(fā)現(xiàn)內(nèi)槽緩沖液漏液，可以將外槽緩沖液加滿到和內(nèi)槽緩沖液齊平。

3.關(guān)于電泳時的電壓：

濃縮膠一般用穩(wěn)壓80-100V，如果使用新鮮的緩沖液，這時的電流應(yīng)該在20mA左右，如果電流太小，請檢查緩沖液以及電泳設(shè)備是否有問題。當(dāng)指示前沿至濃縮膠和分離膠交界時，電壓可以調(diào)高到120-150V。整個電泳時間約需2-3小時。

4.關(guān)于電泳的指示前沿：

由于溴酚藍在Tricine-SDS-PAGE系統(tǒng)中泳動很快，很快就跑到緩沖液中去了。超低分子量蛋白Marker和2×Tricine 上樣緩沖液中的指示前沿是考馬斯亮藍G-250。電泳中只要指示前沿跑不丟，小肽就不會跑丟。然而，考馬斯亮藍G-250作為指示前沿的缺點是在分離膠中比較彌散。如果電泳時間較短，染色時會遮擋3KD左右的小肽。

5.小肽的染色：

由于小肽還有較少的氨基酸，染色時結(jié)合的染料就少，導(dǎo)致染色靈敏度比較低。上樣時要加大上樣量。另外，低于5KD的小提容易從PAGE膠上脫離，染色前最好有個固定步驟(0.5％戊二醛，30%乙醇)。為了更好的染色小肽，可以選擇FastBlue蛋白染色液（Cat No：RTD6202），該產(chǎn)品除具有染色快，無毒，靈敏性高等特點外，還能對小肽在染色中起到固定作用，不至于小肽在染色和脫色中從凝膠中脫離，是常規(guī)染色液的理想替代品。

6.小肽的轉(zhuǎn)膜/Western Blot實驗

由于小肽比較小，轉(zhuǎn)膜時要注意小肽非常容易透過PVDF膜。兩種方法可以解決這一問題：兩張PVDF膜重疊在一起；縮短轉(zhuǎn)膜時間（半干法轉(zhuǎn)移，200mA 15-20分鐘就可以了）。轉(zhuǎn)膜使用0.22 μm的PVDF膜。濕轉(zhuǎn)（轉(zhuǎn)膜緩沖液加20%甲醇，不加或少加SDS，200mA 30-35分鐘）。

7.小肽電泳文獻：

[1] Schagger, H. & von Jagow, G. Tricine–sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1–100 kDalton. Anal. Biochem. 166, 368–379 (1987).

最原始小肽電泳的文獻。

[2] Schagger, H. Tricine–SDS-PAGE. Nature Protocols. 1,16-23，2006

87年的作者Schagger在Nature Protocols 開刊文章，寫的精細，值得推薦。

[3] 兩篇國內(nèi)文獻，主要討論尿素的作用。

(1)多肽的電泳分離 2004

(2)有效分離1kDa小肽的Tricine-SDS-PAGE方法 2004

附.我們實驗室買的小肽Marker說明書