單細(xì)胞研究腫瘤耐藥的高分攻略

昵稱32772025 2023-09-06 發(fā)布于廣東

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研究背景

GBM是最具侵襲性和致命性的原發(fā)性腫瘤，具有廣泛的瘤間和瘤內(nèi)異質(zhì)性。GBM的復(fù)發(fā)不可避免，而腫瘤復(fù)發(fā)與腫瘤異質(zhì)性和腫瘤微環(huán)境（TME）有關(guān)，而且這兩種因素在耐藥性中起著關(guān)鍵作用。但是目前對復(fù)發(fā)性GBM的腫瘤異質(zhì)性、TME和分子特征的了解還很有限。

研究結(jié)果

結(jié)果一：復(fù)發(fā)性GBM圖譜構(gòu)建

對三例復(fù)發(fā)性GBM和三例原發(fā)性GBM患者的腫瘤樣本（TISCH數(shù)據(jù)庫）進(jìn)行scRNA-seq分析，探究GBM TME細(xì)胞組成（圖1A）。來自原發(fā)性IDH野生型GBM的10144個細(xì)胞和來自復(fù)發(fā)性GBM的19982個細(xì)胞分成了22個細(xì)胞群（圖1B）。根據(jù)經(jīng)典細(xì)胞marker鑒定了11種主要細(xì)胞類型，并將其分為腫瘤細(xì)胞類型、內(nèi)皮細(xì)胞類型和免疫細(xì)胞類型（圖1E）。應(yīng)用inferCNV算法分析了參考細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞）和觀察細(xì)胞（免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞）中每個細(xì)胞的CNV來探究復(fù)發(fā)性GBM細(xì)胞的克隆結(jié)構(gòu)。構(gòu)建的參考CNV圖譜揭示了患者間和患者內(nèi)的異質(zhì)性（圖1F）。

圖1 原發(fā)性和復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞組成概況

結(jié)果二：腫瘤異質(zhì)性和細(xì)胞亞群鑒定

作者對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行重聚類，共發(fā)現(xiàn)了16個亞群（圖2C）。發(fā)現(xiàn)這些簇在不同樣本中差異很大，作者推測可能是由于腫瘤表型或腫瘤內(nèi)活檢位置的不同造成的。其中第4、13和14簇在原發(fā)性GBM細(xì)胞中占主導(dǎo)地位，第0和12簇在復(fù)發(fā)性GBM細(xì)胞中占主導(dǎo)地位（圖2E）。歸一化Shannon diversity index用于顯示每位患者主要聚類的均勻度（圖2D）。

圖2 原發(fā)性和復(fù)發(fā)性GBM瘤患者腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞概況

為了進(jìn)一步確定腫瘤細(xì)胞類型，作者使用經(jīng)典細(xì)胞marker對進(jìn)行聚類和注釋（圖3B）。一共確定了九種腫瘤細(xì)胞亞型，分別為星形膠質(zhì)細(xì)胞、CGEin、分裂的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPCs）、未成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞、小鼠干擾素α產(chǎn)生細(xì)胞（mIPCs）、新生神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、OPCs和放射狀膠質(zhì)細(xì)胞（圖3A），并且每個患者都存在幾乎所有的細(xì)胞亞群。復(fù)發(fā)性GBM和原發(fā)性GBM患者之間和樣本內(nèi)部的細(xì)胞類型比例不同且具有顯著差異（圖3C、D）。在原發(fā)性GBM中，CGEin、未成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的比例較高；但在復(fù)發(fā)性GBM中，少突膠質(zhì)細(xì)胞的比例較高（圖3E）。不同病灶中細(xì)胞亞群的比例差異很大，這表明瘤間異質(zhì)性以及病灶間的異致性。為了探究復(fù)發(fā)性GBM TME中細(xì)胞類型之間的相互作用，作者使用CellPhoneDB進(jìn)行了細(xì)胞-細(xì)胞互作分析，發(fā)現(xiàn)分裂的OPCs、OPCs、未成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞之間存在顯著的相互作用（圖3F）。

圖3 樣本中每種細(xì)胞類型的豐度和均勻度

結(jié)果三：復(fù)發(fā)性GBM的發(fā)育軌跡和增殖相關(guān)腫瘤群的識別

根據(jù)Monocle3算法對復(fù)發(fā)性GBM進(jìn)行了軌跡分析，以推斷發(fā)育軌跡。分裂的OPCs被確定為生物過程的起點(diǎn)（圖4A）。KEGG通路分析顯示，簇12富含干細(xì)胞信號通路（圖4B）。而且細(xì)胞增殖相關(guān)基因，包括TOP2A、MKI67、UBE2C、CENPF和PBK，都富集在簇12中，這意味著表型向惡性轉(zhuǎn)變（圖4C）。通過細(xì)胞周期評分發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)GBM中處于G1期和S期的細(xì)胞數(shù)量多于其他階段（圖4D）。作者還發(fā)現(xiàn)CGGA（數(shù)據(jù)庫）膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者隊(duì)列中，具有高放射狀膠質(zhì)細(xì)胞特征的患者比具有低放射狀膠質(zhì)細(xì)胞特征的患者的總生存期（OS）長，而且復(fù)發(fā)的次數(shù)也在增加（圖4E-G）。

圖4 復(fù)發(fā)性GBM的發(fā)育軌跡和增殖相關(guān)腫瘤亞群的識別

結(jié)果四：復(fù)發(fā)性GBM的耐藥機(jī)制

作者采用雙側(cè)Wilcoxon檢驗(yàn)比較原發(fā)性和復(fù)發(fā)性GBM中的差異表達(dá)基因（DEGs）（圖5A）。作者發(fā)現(xiàn)VEGFA在復(fù)發(fā)性GBM中高表達(dá)，而且主要是在放射狀膠質(zhì)細(xì)胞中（圖5B、C）。高級別膠質(zhì)瘤的高代謝需求會產(chǎn)生缺氧區(qū)域，從而引發(fā)VEGF表達(dá)和血管生成增加，導(dǎo)致異常血管和血腦屏障（BBBs）功能失調(diào)。此外，作者還發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性GBM中富集了與MGMT相關(guān)的信號通路（圖5E）。與原發(fā)性GBM相比，復(fù)發(fā)性GBM的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞特征和MGMT基因表達(dá)明顯增加，且與預(yù)后不良相關(guān)（圖5F,G）。免疫組化和免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)了復(fù)發(fā)性GBM中小膠質(zhì)細(xì)胞減少和VEGF蛋白表達(dá)的增加（圖6）。

圖5 識別GBM中與耐藥性相關(guān)的腫瘤細(xì)胞亞群

圖6 原發(fā)性和復(fù)發(fā)性GBM中小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量和VEGF蛋白表達(dá)的變化

討論

復(fù)發(fā)性GBM細(xì)胞的基因表達(dá)程序與原發(fā)性GBM細(xì)胞不同，具有瘤內(nèi)異質(zhì)性。作者利用scRNA-seq在復(fù)發(fā)性GBM中發(fā)現(xiàn)除了0、1和14簇之外的幾乎所有細(xì)胞亞群中都檢測到了VEGFA的過表達(dá)。TME的重塑反過來又會增加VEGFA的表達(dá)，從而刺激血管生成并支持膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長。而先前的研究表明血清VEGFA水平與貝伐珠單抗的治療效果之間存在負(fù)相關(guān)。作者還提出了抑制癌癥增殖、恢復(fù)癌癥免疫循環(huán)和克服免疫抑制微環(huán)境的潛在治療靶點(diǎn):作者提到盡管GBM核心區(qū)的BBB被認(rèn)為是“滲漏”的，但在核心區(qū)以外的大部分區(qū)域和低級別彌漫性膠質(zhì)瘤中的BBB更接近于完整的BBB，可以阻止癌癥治療藥物（包括小分子和抗體）的有效通過。不過，作者發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性GBM的BBB是“滲漏”的，而且目前唯一已知的GBM患者替莫唑胺（TMZ）反應(yīng)的生物標(biāo)志物MGMT相關(guān)信號通路基因在預(yù)后不良的復(fù)發(fā)性GBM中富集。

結(jié)論

腫瘤異質(zhì)性與腫瘤的內(nèi)源性耐藥性有關(guān)，大多數(shù)報道的耐藥性機(jī)制已通過分析bulk數(shù)據(jù)和/或耐藥細(xì)胞系確定。但是作者通過聯(lián)合復(fù)發(fā)性GBM和原發(fā)性GBM的scRNA-seq的研究確定了GBM TME特有的細(xì)胞和生物學(xué)特征，從而提供了可能有助于確定新的治療靶點(diǎn)的見解。

總結(jié)

作者對3個復(fù)發(fā)性GBM患者進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，并在公共數(shù)據(jù)集下載了3個原發(fā)性GBM患者的scRNA-seq數(shù)據(jù)作為對照，從而構(gòu)建了復(fù)發(fā)性GBM的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜圖。鑒定出腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞，并通過inferCNV算法鑒定出惡性細(xì)胞，進(jìn)而探究GBM的個體特異性和瘤內(nèi)異質(zhì)性。

然后，作者提取癌細(xì)胞并進(jìn)一步鑒定癌細(xì)胞的組成來分析GBM TME的異質(zhì)性。通過Cellphone DB分析GBM TME中細(xì)胞的互作關(guān)系。

隨后，作者對識別的癌細(xì)胞的細(xì)胞亞群進(jìn)行軌跡分析和功能富集分析，來鑒定可能或已發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變的細(xì)胞亞群。進(jìn)一步通過CGGA膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者隊(duì)列中比較具有高放射狀膠質(zhì)細(xì)胞特征的患者比具有低放射狀膠質(zhì)細(xì)胞特征的患者的總生存期和復(fù)發(fā)的次數(shù)。

最后，作者通過對原發(fā)性GBM和復(fù)發(fā)性GBM進(jìn)行差異分析，識別到復(fù)發(fā)性GBM中的高表達(dá)基因及主要表達(dá)這些基因的細(xì)胞亞群，進(jìn)而分析這些基因影響到的通路和與預(yù)后的關(guān)系，從而闡明GBM的耐藥機(jī)制，并通過濕實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

看到最后，我們可以發(fā)現(xiàn)作者的設(shè)計(jì)環(huán)環(huán)相扣、層層遞進(jìn)，故事性也很強(qiáng)，是一篇值得仔細(xì)研讀的文章。

【參考文獻(xiàn)】

Single-cell RNA sequencing reveals tumor heterogeneity,microenvironment, and drug-resistance mechanisms ofrecurrent glioblastoma

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