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Overexpression of POLA2 in hepatocellular carcinoma is involved in immune infiltration and predicts a poor prognosis 肝細(xì)胞癌中POLA2的過(guò)表達(dá)參與了免疫浸潤(rùn)并預(yù)示著不良預(yù)后 發(fā)表期刊：Cancer Cell Int 發(fā)表日期：2023 Jul 14 影響因子：5.8 DOI: 10.1186/s12935-023-02949-z 肝細(xì)胞癌（HCC）是全球第二大致命惡性腫瘤，占所有原發(fā)性肝癌的大多數(shù)（約90%）。目前，許多有效的治療方法，包括手術(shù)切除腫瘤、介入技術(shù)和肝移植，都被用于治療肝癌。DNA聚合酶是在基因組復(fù)制和修復(fù)中發(fā)揮重要作用的酶。這些蛋白質(zhì)不僅在維持正常細(xì)胞存活方面發(fā)揮作用，而且在癌癥的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中也發(fā)揮著作用。因此，抑制DNA聚合酶的表達(dá)可有效抑制癌細(xì)胞的增殖。在HCC中，抑制DNA聚合酶A、D和E可抑制AFP陽(yáng)性HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)。1）TCGA：HCC患者的臨床數(shù)據(jù)、RNA-seq讀數(shù)數(shù)據(jù)：424例HCC樣本和50例鄰近非癌組織樣本2）HCCDB（肝細(xì)胞癌整合分子數(shù)據(jù)庫(kù)）中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)作為補(bǔ)充數(shù)據(jù)3）從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中收集了354例HCC患者的體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)4）HCC冷凍標(biāo)本和鄰近癌旁組織來(lái)自24例HCC患者5）HCC細(xì)胞（HepG2、SMMC-7721、MHCC-97和SK-Hep1）和人正常肝細(xì)胞系LO2細(xì)胞7）免疫細(xì)胞特異性基因收集自一項(xiàng)已發(fā)表的研究，該研究包含28種特異性標(biāo)記的瘤內(nèi)免疫細(xì)胞的782個(gè)免疫相關(guān)基因1）分析POLA1和POLA2在HCC中的表達(dá)情況：通過(guò)Wilcoxon檢驗(yàn)配對(duì)組和非配對(duì)組分析HCC樣本和鄰近非癌組織樣本中POLA2的表達(dá)水平；POLA1和POLA2在不同臨床分期系統(tǒng)（T/N/M、分級(jí)、分期）中的mRNA水平也通過(guò)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行了分析2）POLA1和POLA2在HCC中的生存分析：對(duì)OS預(yù)后進(jìn)行多變量Cox回歸分析，分析POLA2表達(dá)值與HCC患者臨床病理信息（包括T、N、M、分期、分級(jí)）的顯著相關(guān)性3）POLA2在HCC中的突變數(shù)據(jù)分析：為了識(shí)別POLA2高表達(dá)組和低表達(dá)組突變基因的變異，使用R軟件包'TCGAmutations'和'maftools'進(jìn)行突變分析；'maftools'軟件包中的'tmb'函數(shù)還計(jì)算了TCGA-LIHC樣本的腫瘤突變負(fù)荷（TMB）；利用cbioportal數(shù)據(jù)庫(kù)分析了從POLA2高表達(dá)組和低表達(dá)組中選出的這些顯著差異基因的基因突變對(duì)OS的影響4）細(xì)胞系和細(xì)胞轉(zhuǎn)染、定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）、Western印跡檢測(cè)、檢測(cè)POLA2對(duì)HCC細(xì)胞的功能作用5）腫瘤發(fā)生研究、免疫組化染色（IHC）：小鼠6）HCC中浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的分析：利用xCell算法和TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)對(duì)TCGA-LIHC患者進(jìn)行免疫浸潤(rùn)分析；基于HPA數(shù)據(jù)集、摩納哥數(shù)據(jù)集和施米德?tīng)枖?shù)據(jù)集的RNA-seq數(shù)據(jù)，人類蛋白質(zhì)圖譜（HPA）網(wǎng)站進(jìn)一步分析了POLA2在血細(xì)胞中的表達(dá)水平7）HCC中與POLA2相關(guān)的免疫細(xì)胞基因和檢查點(diǎn)分析：皮爾遜相關(guān)分析；Metascape用于分析POLA2共表達(dá)免疫相關(guān)基因的潛在功能；選取了8個(gè)具有代表性的免疫檢查點(diǎn)基因（CD274、HAVCR2、PDCD1、CTLA4、LAG3、SIGLEC15、TIGIT和PDCD1L）的表達(dá)水平來(lái)探討其與POLA2的共表達(dá)關(guān)系01 - POLA1和POLA2在HCC和正常肝組織中的差異表達(dá)為了研究POLA1和POLA2在HCC中的作用，作者首先分析了基于TCGA的50個(gè)配對(duì)樣本和424個(gè)HCC患者樣本中的POLA1和POLA2mRNA或蛋白水平。結(jié)果顯示，在TCGA全部樣本中，與正常樣本相比，POLA1和POLA2在腫瘤組織中的表達(dá)明顯升高（圖1A/C）。進(jìn)一步分析了配對(duì)樣本（腫瘤和正常組織均來(lái)自同一患者），發(fā)現(xiàn)超過(guò)95%的患者腫瘤組織中POLA1和POLA2的表達(dá)高于正常組織（圖1B/D）。而來(lái)自HCCDB的數(shù)據(jù)也表明，POLA1和POLA2在HCC中均有上調(diào)。然后，研究了POLA1和POLA2在不同臨床病理特征的HCC中的表達(dá)差異。據(jù)觀察，POLA1和POLA2表達(dá)值越高與T期、臨床分期和分級(jí)相關(guān)。此外，POLA2還與HCC患者的M分期相關(guān)（圖1E-F）。 圖1 來(lái)自 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的 POLA1 和 POLA2 在 HCC 中的表達(dá)分析
02 - POLA1或POLA2在HCC中的生存預(yù)后分析為了評(píng)估POLA1和POLA2對(duì)生存預(yù)后的影響，研究人員將HCC病例按其POLA1和POLA2 mRNA水平分為高、低兩組。結(jié)果顯示，高水平的POLA1和POLA2會(huì)顯著縮短HCC的總生存時(shí)間（圖2A-B）。PLOA1高表達(dá)組和低表達(dá)組的中位總生存時(shí)間分別為2.46年和5.84年。而PLOA2高表達(dá)組和低表達(dá)組的中位總生存時(shí)間分別為1.98年和5.37年。通過(guò)相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)POLA1和POLA2具有顯著的共表達(dá)相關(guān)性，并且這種相關(guān)性相互影響著對(duì)肝細(xì)胞癌總生存時(shí)間的預(yù)測(cè)。隨后的ROC分析表明，POLA2（AUC 0.961）比POLA1（AUC 0.884）更能區(qū)分肝細(xì)胞癌和正常組織。多變量COX回歸分析顯示，POLA2、T3/4分期、M分期、III/IV期可作為HCC的獨(dú)立預(yù)后因素（圖2C-D）。為了更詳細(xì)地探討這些因素對(duì)HCC患者預(yù)后的影響，采用Kaplan-Meier分析法分別探討了POLA2表達(dá)組與T期、M期、N期、分期、病理分級(jí)或預(yù)后年齡的關(guān)系（圖2E-J）。POLA2在所有測(cè)試的臨床組別中都顯示出明顯的預(yù)后作用。此外，在所有這些不同組別中，同一臨床組別中POLA2高和POLA2低的HCC患者的OS差異顯著。結(jié)果顯示，就HCCT1組而言，與低POLA2患者相比，高POLA2患者的生存預(yù)后較差（圖2E）。在N0期（圖2F）、M0期（圖2G）、I期、II期、III期（圖2H）、3級(jí)（圖2I）和65歲以上患者（圖2J）中也發(fā)現(xiàn)了這種明顯的預(yù)后。由于納入的患者數(shù)量不足，雖然在某些臨床組別中，POLA2高表達(dá)和低表達(dá)患者并無(wú)明顯差異，但生存曲線也呈現(xiàn)出差異趨勢(shì)?？傊?，POLA2在HCC組織中的高表達(dá)將顯著縮短HCC患者的總生存時(shí)間，POLA2的表達(dá)水平可能是評(píng)估HCC患者預(yù)后的有效標(biāo)志物。這些結(jié)果表明，POLA2對(duì)HCC患者的預(yù)后有明顯影響，并可能為預(yù)測(cè)HCC的預(yù)后提供更高的效力。 圖2 全面分析 POLA1/2 表達(dá)和臨床病理學(xué)對(duì) HCC 預(yù)后的影響
與鄰近的非腫瘤組織相比，在6例HCC樣本中也檢測(cè)到了POLA2水平的升高（圖3A）。24例HCC組織中POLA2mRNA水平與臨床病理因素的相關(guān)性分析表明，POLA2與HCC中腫瘤分化水平、腫瘤大小和Ki-67顯著相關(guān)（圖3B）。此外，免疫組化（IHC）染色顯示，與匹配的正常肝組織相比，POLA2在HCC組織中的表達(dá)明顯增加（圖3C）。根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析，POLA2與HCC中MKI67（Ki-67）和GPC3的表達(dá)密切相關(guān)（圖3D）。這些結(jié)果不僅驗(yàn)證了POLA2在HCC組織中的表達(dá)水平升高，還令人信服地證實(shí)了POLA2與HCC臨床病理因素之間的相關(guān)性。 圖3 HCC 樣本中 POLA2 表達(dá)水平與臨床病理因素的相關(guān)性
03 - POLA2表達(dá)水平與HCC基因突變的相關(guān)性POLA2在DNA修復(fù)和基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用。此外，基因突變?cè)诎┌Y發(fā)展中也起著重要作用。因此，作者分析了基因突變與POLA2表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果顯示，POLA2高表達(dá)組和低表達(dá)組前20個(gè)突變基因的突變率分別為91.4%和86.59%（圖4A）。高表達(dá)組的前五個(gè)基因是TP53、TTN、MUC16、PCLO和OBSCN，而低表達(dá)組的前五個(gè)基因是CTNNB1、TTN、TP53、MUC16和ALB（圖4A）。在POLA2的高表達(dá)組和低表達(dá)組之間，共有17個(gè)基因的突變率存在顯著差異，其中只有CTNNB1在低表達(dá)組中突變率較高（圖4B）。除此之外，在POLA2低表達(dá)的HCC中，CTNNB1的突變率明顯更高。多項(xiàng)研究表明，CTNNB1基因突變的HCC表現(xiàn)出一種特殊的表型，即具有微疣樣假腺體結(jié)構(gòu)模式的分化良好的腫瘤，這與POLA2低表達(dá)的HCC患者預(yù)后較好是一致的。生存期分析還顯示，擁有這17個(gè)基因突變的患者的中位生存期明顯低于廣義型患者。變異組和未變異組的中位生存時(shí)間分別為51.25個(gè)月和80.68個(gè)月（圖4C）。高表達(dá)組和低表達(dá)組不同突變基因的變異等位基因頻率（VAF）詳見(jiàn)圖4D。腫瘤突變負(fù)荷（TMB）也與POLA2的表達(dá)呈正相關(guān)，高表達(dá)組和低表達(dá)組的TMB分別為1.72MB和1.6MB（圖4E）。在POLA2高表達(dá)組中，不同突變基因（KIF19/TGM7、TGM7/SIGLEC12和NBR1/KIG19）的共同突變更為顯著（圖4F）。這些結(jié)果表明，POLA2是HCC中密切相關(guān)的基因突變。這可能也是POLA2水平較高的HCC預(yù)后較差的原因之一。 圖4 POLA2 對(duì) HCC 基因突變的影響
04 - POLA2對(duì)HCC生物功能的影響與人源肝細(xì)胞系LO2相比，POLA2在SMMC-7721、HepG2、SK-Hep1和MHCC-97中的表達(dá)水平均顯著過(guò)表達(dá)（圖5A）。然后作者降低了POLA2在SMMC-7721和HepG2細(xì)胞中的表達(dá)水平，因?yàn)樗鼈兪菣z測(cè)到的POLA2表達(dá)量最高的兩種HCC細(xì)胞系。GFP標(biāo)記的POLA2-sh和陰性對(duì)照證明了慢病毒在HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染POLA2-sh對(duì)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的增殖有不同程度的抑制作用（圖5B）。經(jīng)過(guò)篩選，選擇了POLA2-sh1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樗那贸屎芨撸▓D5C）。轉(zhuǎn)染后，HCC細(xì)胞中的POLA2蛋白水平明顯降低（圖5D）。 圖5 POLA2 在 HCC 細(xì)胞系中的表達(dá)水平
用CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染POLA2sh后HepG2和SMMC-7721的存活率（圖6A）。通過(guò)菌落形成分析，POLA2基因敲除后，HepG2和SMMC-7721的增殖能力也明顯受到抑制。劃痕試驗(yàn)顯示，POLA2基因敲除后，HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的傷口愈合能力受到明顯抑制（圖6B）。通過(guò)Transwell細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，POLA2敲除明顯降低了HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖6C-D）。最后，降低POLA2在HepG2和SMMC-7721中的表達(dá)水平后，細(xì)胞周期的G1期比率明顯增加，這表明POLA2-sh阻礙了細(xì)胞周期的進(jìn)程（圖6E）。實(shí)驗(yàn)表明，POLA2的異常表達(dá)通過(guò)影響腫瘤的增殖、遷移、侵襲和細(xì)胞周期，加速了腫瘤相關(guān)生物學(xué)功能的惡性進(jìn)程，進(jìn)而介導(dǎo)了HCC患者的不良預(yù)后。 圖6 POLA2 對(duì) SMMC-7721 和 HepG2 生物功能的影響
為了進(jìn)一步了解POLA2在HCC中的功能，作者建立了HCC異種移植腫瘤模型。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染POLA2sh的HepG2細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi)（圖7A）。與NC組相比，POLA2-sh組明顯抑制了HepG2腫瘤的生長(zhǎng)。肉眼觀察（圖7B-C）和切除腫瘤的重量（圖7D）進(jìn)一步證明了抑制POLA2對(duì)腫瘤的顯著抑制作用。免疫組化檢測(cè)顯示，與腫瘤增殖密切相關(guān)的Ki-67的表達(dá)水平在POLA2sh組明顯低于陰性對(duì)照組（圖7E）。同樣，腫瘤組織的HE染色顯示，POLA2sh組的壞死面積大于陰性對(duì)照組，這表明低水平的POLA2會(huì)抑制HCC細(xì)胞的存活（圖7F）。 圖7 在異種移植腫瘤模型中，POLA2 的表達(dá)影響腫瘤大小、腫瘤增殖和腫瘤壞死
05 - POLA2表達(dá)影響HCC的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)作者通過(guò)TIMER進(jìn)一步探討了POLA2與浸潤(rùn)免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性（圖8A）。POLA2的表達(dá)水平與T細(xì)胞CD4 Th1、T細(xì)胞CD4 Th2、T細(xì)胞NK和常見(jiàn)淋巴祖細(xì)胞的浸潤(rùn)水平呈顯著正相關(guān)（圖8F-I）。然而，造血干細(xì)胞、基質(zhì)分、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞M2與POLA2的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)（圖8B-E）。結(jié)果表明，POLA2也可能通過(guò)影響免疫細(xì)胞在HCC中的浸潤(rùn)而影響腫瘤患者的預(yù)后。來(lái)自HPA、Monaco和Schmiedel的免疫細(xì)胞類型表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，IGF2BP2在大多數(shù)免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá)。這些結(jié)果可能反映了肝癌患者腫瘤組織中免疫細(xì)胞中POLA2的廣泛表達(dá)。因此，干預(yù)POLA2的表達(dá)可能會(huì)影響免疫細(xì)胞在肝癌組織中的浸潤(rùn)。 圖8 POLA2 與 HCC 中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系
POLA2與免疫細(xì)胞標(biāo)志基因的相關(guān)性研究結(jié)果顯示，POLA2與355個(gè)免疫細(xì)胞相關(guān)基因存在共表達(dá)關(guān)系，其中304個(gè)基因呈正相關(guān)。在這些共表達(dá)基因中，最重要的相關(guān)基因均呈正相關(guān)，具體如下：BIRC5、CDC25C、CDC7、CENPF、HELLS（2型T輔助細(xì)胞）；CFL1（單核細(xì)胞）；CDKN3、CCNA2（記憶B細(xì)胞）；LMNB1、DBNL（γδT細(xì)胞）；EZH、TIPIN、EXOSC9（效應(yīng)記憶CD4T細(xì)胞）；XPO6（活化的樹(shù)突狀細(xì)胞）；CSE1L（活化的CD8T細(xì)胞）；EXO1、CCNB1、KIF11、NUF2、PRC1、KNTC1、ESCO2、BRIP1、RTKN2（活化的CD4T細(xì)胞）（圖9A）。由于POLA2影響了HCC免疫微環(huán)境的浸潤(rùn)，作者通過(guò)功能富集研究了POLA2的確切功能通路。通過(guò)MEXPRESS分析，上述355個(gè)基因分別富集在細(xì)胞活性、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物和白細(xì)胞活性、免疫應(yīng)答調(diào)控的細(xì)胞表面受體信號(hào)通路和免疫應(yīng)答調(diào)控的信號(hào)通路中（圖9B）。盡管DisGeNET人類疾病結(jié)果顯示，POLA2共表達(dá)基因也富集于一些免疫相關(guān)疾病，如肝炎、感染、不同的白血病或淋巴瘤等（圖9C）。作者進(jìn)一步研究了POLA2與已發(fā)表的8個(gè)免疫檢查點(diǎn)之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，除SIGLEC15外，POLA2與CD274、CTL-4、HAVCR2、PDCD1、PDCD1LG2、TIGIT和LAG3均有明顯相關(guān)性（圖9E-L）。在本研究中，基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析，發(fā)現(xiàn)POLA2與PDL-1在HCC中的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)。然后，在肝癌細(xì)胞系SMMC-7721和HepG2中敲除POLA2，發(fā)現(xiàn)PD-L1蛋白水平也持續(xù)受到抑制。這些結(jié)果表明，POLA2可能會(huì)影響PD-L1在HCC中的表達(dá)（圖9M）。這可能是由于DNA聚合酶家族成員POLA2通過(guò)直接或間接的方式促進(jìn)了PD-L1在HCC中的產(chǎn)生。上述研究表明，POLA2在HCC的免疫中可能發(fā)揮著重要作用。圖9 POLA2 與 HCC 中的浸潤(rùn)免疫細(xì)胞標(biāo)記物和免疫檢查點(diǎn)密切相關(guān) POLA2的高表達(dá)與HCC的惡性表型和較差的預(yù)后相關(guān)。突變分析表明，POLA2與HCC基因突變有關(guān)。此外，POLA2還參與調(diào)節(jié)多種免疫通路，并與腫瘤免疫微環(huán)境和免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)相關(guān)。因此，本研究表明，POLA2可能是一種有前景的HCC預(yù)后和免疫治療預(yù)測(cè)標(biāo)志物。如果喜歡本篇內(nèi)容，希望大家點(diǎn)個(gè)贊與在看哦~
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