一. 研究背景

膠質(zhì)母細胞瘤的腫瘤微環(huán)境復(fù)雜，其中免疫細胞是腫瘤惡性程度的調(diào)節(jié)因子，而干擾素(IFN)是公認的調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的重要家族，且IFN-α/β已廣泛應(yīng)用于惡性膠質(zhì)瘤的治療，而IFN-γ在GBM中可能起著不同的作用，作者基于此展開研究。

二. 分析流程

三. 結(jié)果解讀

1. ISGs在膠質(zhì)瘤中表達失調(diào)

作者首先挑選了20個經(jīng)典的IFN-γ刺激基因(ISG)，探討其在膠質(zhì)瘤中的預(yù)后價值。

A圖：(數(shù)據(jù)來源：CGGA) 由RNA測序繪制出的ISGs表達水平的熱圖

B圖：(數(shù)據(jù)來源：TCGA) 由RNA測序繪制出的ISGs表達水平的熱圖

作者將患者按生存期長短分為兩組，并分析ISG的表達差異，發(fā)現(xiàn)短生存期分別有7個(CGGA)和9個(TCGA)ISG顯著上調(diào)，其中有5個交叉基因(ISG20，IFI30，IFI44，IFITM2，IFITM3)，他們可能與膠質(zhì)瘤的預(yù)后不良相關(guān)。

2. IFI30被認為是GBM中具有預(yù)后價值的最重要ISG基因

C圖：(數(shù)據(jù)來源：CGGA RNA-seq) 不同基因高/低表達的對數(shù)秩生存分析森林圖

D圖：(數(shù)據(jù)來源：TCGA RNA-seq) 不同基因高/低表達的對數(shù)秩生存分析森林圖

為了找出一個預(yù)后最穩(wěn)定的ISG，作者對低級膠質(zhì)瘤(LGG)和膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)進行對數(shù)秩生存分析，結(jié)果顯示只有IFI30具有穩(wěn)定的預(yù)后值。

【注：在補充圖中，作者驗證IFI30表達水平較高的患者總生存期較短?！?/span>

為了進一步評估IFI是否可作為獨立預(yù)后因素，作者進行單因素和多因素cox回歸分析(表1)，結(jié)果表明其可作為一個可靠的獨立因素。

3. IFI30的表達與GBM的惡性亞型相關(guān)

A-C圖：IFI30的表達與腫瘤分級的關(guān)系

D-F圖：IFI30在不同亞型內(nèi)的表達情況

G-I圖：預(yù)測間充質(zhì)亞型膠質(zhì)瘤的ROC曲線

J圖：不同級別膠質(zhì)瘤的免疫組化分析

作者運用三種數(shù)據(jù)庫分析(CGGA RNA-seq、TCGA RNA-seq、CGGA microarray)，發(fā)現(xiàn)IFI30的表達與WHO的評分呈正相關(guān)(圖2A-C)，隨后利用免疫組化進一步驗證IFI30在膠質(zhì)瘤的侵襲性亞型中優(yōu)先表達，可能與膠質(zhì)瘤的惡性程度有關(guān)(圖2J)。

此外，作者還發(fā)現(xiàn)IFI30在IDH1野生型、MGMT啟動子未甲基化以及間充質(zhì)亞型的膠質(zhì)瘤中表達更高(圖2D-F)，而ROC曲線分析證實其可作為間充質(zhì)亞型良好的預(yù)測因子(圖2G-I)。

【注：IDH1突變和MGMT啟動子甲基化是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生的兩個主要因素，但IFI30表達反而降低，似乎與結(jié)論矛盾，因此作者隨后探討IFI30在其中的預(yù)測價值?！?/span>

4. IDH1和MGMT啟動子狀態(tài)對GBM中IFI30的預(yù)測價值的影響

A-L圖：生存分析以揭示IFI30的預(yù)后價值與IDH1和MGMT啟動子狀態(tài)之間的關(guān)系。

在IDH1野生型患者中，IFI30低表達與高表達組均存在顯著生存差異(TCGA RNA-seq除外)，而在IDH1突變患者中無統(tǒng)計學(xué)上差異；類似的，MGMT啟動子甲基化患者中，IFI30低表達與高表達組均存在顯著生存差異，而在MGMT啟動子未甲基化的患者中無明顯差異。

5. IFI30高表達的特異性體細胞突變和拷貝數(shù)改變

A圖：IFI30高/中/低表達的體細胞突變信息

B圖：IFI30高/低表達的30組差異突變基因

在高表達組中，RB1中顯示出高突變頻率，而在低表達組中，IDH1、ATRX、PDGFRA和MROH2B突變頻率更高。

C圖：IFI30高/低表達的基因拷貝數(shù)變異總體水平

D圖：IFI30高/低表達的基因拷貝數(shù)變異差異水平

高表達組存在5號、22號和X號染色體部分片段擴增和8號染色體部分片段缺失。雖然兩組間1p和19q等重要染色體片段的拷貝數(shù)無顯著差異，但IFI30高表達擴增的基因，如NRIP1和SSBP2，可能促進了膠質(zhì)瘤惡性程度。

6. IFI30高表達導(dǎo)致GBM化療耐藥

接下來作者進行不同條件下的生存分析，以探究IFI30表達與治療反應(yīng)的關(guān)系。

A圖：接受化療的GBM患者中，IFI30低表達組具有生存優(yōu)勢

B圖：未接受化療的GBM患者中，兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異

C圖：在IFI30低表達組中，接受化療的患者存活時間更長

D圖：在IFI30高表達組中，化療的治療效益不佳

E-F圖：無論是否化療，僅IFI低水平+MGMT啟動子甲基化的患者相對于未甲基化組具有生存優(yōu)勢

G-H圖：在MGMT啟動子甲基化情況下，IFI低水平組化療的治療效益更佳

7. IFI30參與了GBM細胞的惡性表型和耐藥性

A圖：在不同膠質(zhì)瘤細胞株中IFI30 mRNA水平的柱狀圖

B圖：不同濃度的IFN-γ誘導(dǎo)IFI30表達情況的柱狀圖

C圖：qPCR驗證兩個siRNA的敲除效率

D圖：細胞的侵襲和遷移實驗

E圖：不同濃度的TMZ對細胞的抑制作用

F圖：(數(shù)據(jù)來源：CGGA RNA-seq) GSEA分析

G圖：WB實驗證實敲除IFI30基因降低了IL6和STAT6的表達

作者發(fā)現(xiàn)U87細胞株中IFI30 mRNA含量最高(圖6A)，并在U87細胞株中驗證了IFN-γ可顯著誘導(dǎo)IFI30的過度表達(圖6B)。隨后構(gòu)建siRNA并由qPCR驗證(圖6C)，并在體外細胞實驗證實IFI30可促進細胞的侵襲和遷移(圖6D)。

作者用不同濃度TMZ處理細胞以驗證IFI30對細胞耐藥性的作用(圖6E)，并用GSEA研究IFI30介導(dǎo)的分子機制，發(fā)現(xiàn)IL6和STAT信號通路富集(圖6F)，最后利用WB實驗證實敲除IFI30可抑制IF6和STAT6的表達(圖6G)，即IFI30可能通過促進IF6和STAT6表達，促進GBM化療耐受性。

8. IFI30與白細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)增強以及免疫微環(huán)境相關(guān)

隨后作者為了確定與IFI30高表達最相關(guān)的生物學(xué)過程，總結(jié)了一個IFI30相關(guān)基因群。

A圖：(數(shù)據(jù)來源：CGGA RNA-seq) 對IFI30相關(guān)基因的GO分析

分析表明這些基因在巨噬細胞分化和單核細胞遷移的調(diào)節(jié)中富集。

B圖：(數(shù)據(jù)來源：CGGA RNA-seq) GSEA 分析驗證IFI30生物學(xué)功能

高表達組的免疫應(yīng)答和白細胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)增強。

C圖：IFI30與免疫相關(guān)基因簇的關(guān)系熱圖

由于IFI30與活化免疫應(yīng)答相關(guān)，作者進一步研究了IFI30與各種刺激活性信號的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)其參與巨噬細胞活化、T細胞相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗原提呈細胞過程。

D圖：(數(shù)據(jù)來源：CGGA) CIBERSORT算法證實IFI30與巨噬細胞相關(guān)

M0巨噬細胞在高表達組中顯著富集。

E圖：(數(shù)據(jù)來源：TCGA) CIBERSORT算法證實IFI30與巨噬細胞相關(guān)

M2巨噬細胞在高表達組中顯著富集。

F圖：免疫熒光法檢驗IFI30和CD163

CD163為M2巨噬細胞標記物，與IFI30協(xié)同定位和表達。

G圖：(數(shù)據(jù)來源：CGGA) IFI30與免疫抑制檢查點的關(guān)系圖

IFI30與HAVCR2(也成為粘蛋白結(jié)構(gòu)域3)高度相關(guān)。

這些結(jié)果表明IFI30在調(diào)節(jié)導(dǎo)致膠質(zhì)瘤惡性進展的免疫微環(huán)境中起著關(guān)鍵作用。

作者通過TCGA、CCGA數(shù)據(jù)庫，篩選出膠質(zhì)瘤中差異表達的IFN-γ刺激基因，隨后通過對數(shù)秩生存分析進一步挑選出預(yù)后穩(wěn)定的IFI30，并研究其生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)其可以增強免疫反應(yīng)，影響腫瘤微環(huán)境，并與腫瘤惡性表型以及化療耐藥相關(guān)，是一個良好的預(yù)測變量，但IDH1突變或MGMT啟動子未甲基化會導(dǎo)致其預(yù)測價值降低。