鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收集了NASH患者和健康對(duì)照(HC)的血液和肝組織樣本；8-10周齡雄性C57BL/6J小鼠；石蠟包埋肝臟切片

為了進(jìn)行血漿代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)分析，從21名活檢證實(shí)的NASH患者和30名健康志愿者中收集血樣。NASH組和健康對(duì)照組(healthy controls,HC)組在年齡、性別和臨床參數(shù)包括堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)和間接膽紅素(IBIL)方面沒(méi)有顯著差異。NASH患者顯示較高的體重指數(shù)(BMI)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和甘油三酯(TG)水平，以及較低水平的高密度脂蛋白(HDL)和血清肌酐(SCR)，參與者的具體臨床特征總結(jié)見表1。

采用Label free蛋白組學(xué)方法研究NASH患者與HC患者肝臟中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。在兩組中共鑒定到6475個(gè)蛋白質(zhì)，其中在NASH患者中獲得了603個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)(FC>2.0和p<0.05)，包括265個(gè)上調(diào)和338個(gè)下調(diào)的蛋白質(zhì)(圖1A-C)。GO分析顯示，603個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)中有393個(gè)與代謝過(guò)程有關(guān)。KEGG功能富集分析還表明，差異表達(dá)的蛋白質(zhì)主要富集在過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)途徑、甲狀腺激素信號(hào)途徑、胰高血糖素信號(hào)途徑和中心碳代謝中，這些途徑與代謝穩(wěn)態(tài)和NASH發(fā)展密切相關(guān)(圖1D)。與PPAR信號(hào)通路和脂質(zhì)代謝相關(guān)的差異表達(dá)蛋白見 (圖1E)。參與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)的必需蛋白(脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CD36(CD36)、脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP) 3和FABP4、FA生物合成(蘋果酸酶1，ME1)和脂滴蛋白(PLIN1、PLIN2、PLIN4和PLIN5)的表達(dá)在NASH患者中顯著升高。相比之下，NASH組顯示載脂蛋白A1 (APOA1)和APOA2蛋白表達(dá)減少。這些結(jié)果表明，NASH患者的血脂譜發(fā)生明顯改變。此外，NASH患者肝臟中負(fù)責(zé)糖酵解的關(guān)鍵蛋白顯著上調(diào)，包括己糖激酶結(jié)構(gòu)域1 (HKDC1)、6-磷酸果糖激酶1 (PFKM)、磷酸甘油突變酶2 (PGAM2)、丙酮酸激酶M1/2 (PKM)和丙酮酸脫氫酶E1亞基β (PDHB)(圖1 E)。作者還發(fā)現(xiàn)NASH廣泛調(diào)節(jié)嘌呤代謝和甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的表達(dá)(圖1F)。這些發(fā)現(xiàn)表明，與代謝穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生了改變。

作者為了表征NASH患者的代謝途徑，利用靶向代謝組學(xué)方法，對(duì)350多種代謝物進(jìn)行檢測(cè)。熱圖(圖2A)顯示，NASH患者的100種代謝物(69種升高，31種降低)發(fā)生了顯著變化。受影響的代謝途徑主要包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸的代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成以及嘌呤的代謝(圖2B、C)。與對(duì)照組相比，NASH患者的膽酸(CA)、熊去氧膽酸(UDCA)和結(jié)合型BAs顯著增加，表明BAs的異常代謝可能導(dǎo)致NAFLD進(jìn)展(圖2D)。作者還發(fā)現(xiàn)在NASH患者血漿中與支鏈氨基酸(BCAAs)生物合成和降解相關(guān)的代謝物表達(dá)升高(圖2D)，如L-蘇氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、4甲基-2-氧五酸酯和芳香氨基酸(AAAs)生物合成(L-苯丙氨酸、L-酪氨酸)。NASH上調(diào)了參與氧化和炎癥調(diào)節(jié)的幾種重要代謝物，包括谷氨酸、谷氨酰胺、吡啶酸、犬尿氨酸和衣康酸(圖2E)。NASH患者血漿丙酮酸升高(圖2E)，這與糖酵解蛋白上調(diào)一致(圖1E)。

作者為探索NASH患者的脂質(zhì)組成，進(jìn)一步進(jìn)行靶向脂質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜分析，定量超過(guò)800種脂質(zhì)。熱圖分析顯示兩組在許多脂類上存在明顯差異(圖3A)。NASH患者血漿中共有151種脂質(zhì)發(fā)生顯著改變，其中58種顯著升高。差異表達(dá)的脂質(zhì)主要為PE(22.70%)、PI(12.77%)、PC(12.06%)、TAG(9.93%)、PS(7.09%)和DAG(6.38%)(圖3B)。如圖3C所示，與對(duì)照組相比，NASH組DAG、TAG、PI和二氫神經(jīng)酰胺(DCER)的相對(duì)含量顯著上調(diào)，而PG、PC、PS、LPC和CE的水平則下調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，NASH患者的脂質(zhì)譜發(fā)生了顯著變化。

作者進(jìn)一步對(duì)代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法在NASH患者中鑒定的關(guān)鍵代謝紊亂和凋亡途徑進(jìn)行概述（圖4）。FA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FABPs和CD36)的上調(diào)促進(jìn)脂質(zhì)進(jìn)入肝臟。負(fù)責(zé)糖酵解關(guān)鍵蛋白質(zhì)的上調(diào)促進(jìn)了丙酮酸的產(chǎn)生，進(jìn)一步用于FA合成。在NASH患者中，DAG和TAG的含量以及脂滴蛋白(PLIN1、PLIN2、PLIN4和PLIN5)的含量顯著升高，共同刺激了NASH肝臟中的脂質(zhì)積累。同時(shí)，磷脂(PC、PI、PG和PS)代謝紊亂可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、線粒體和胞漿功能紊亂。代謝組學(xué)數(shù)據(jù)顯示，在NASH患者觀察到BCAAs、AAAs和BAs的積累，與胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、血糖控制受損等發(fā)病因素有關(guān)。代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)表明，NASH患者嘌呤生物合成增強(qiáng)。同時(shí)，NASH患者肝臟中參與外源性和內(nèi)源性信號(hào)通路誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡的蛋白表達(dá)顯著增加。總之，NASH以氨基酸、BAs、葡萄糖和脂質(zhì)代謝紊亂為特征，所有這些因素可能共同誘導(dǎo)NAFLD發(fā)病機(jī)制。