【原】特別關(guān)注｜脂多糖在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用

臨床肝膽病雜志 2023-08-12 發(fā)布于吉林

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肝癌是一種由多種因素導(dǎo)致的肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞癌變所形成的惡性腫瘤，是我國(guó)及世界范圍內(nèi)重大的公共衛(wèi)生疾病。2020年全球統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)^[1]顯示，肝癌新發(fā)病例數(shù)在全球常見惡性腫瘤中排名第六位，是全球第三大癌癥死亡病因。腸道微生物群是與人體共生的微生態(tài)系統(tǒng)，由細(xì)菌、真菌、古細(xì)菌及病毒組成，攜帶的遺傳信息約為人類基因組的100倍以上，承擔(dān)協(xié)助消化、膽汁酸循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫等多重生理功能，又稱為“被遺忘的器官”。近年來，多項(xiàng)研究證實(shí)腸道微生物特別是腸道細(xì)菌參與肝癌的形成、進(jìn)展、轉(zhuǎn)歸及治療過程并起重要生物學(xué)作用^[2-3]。革蘭陰性細(xì)菌獨(dú)特的外膜結(jié)構(gòu)——脂多糖(LPS) 大多由核心糖、Kdo2-類脂A(Kdo2-Lipid A)、O-抗原三部分構(gòu)成，其中Lipid A是主要成分^[4]。LPS作為重要的毒力因子與保護(hù)性抗原，在多種病理狀態(tài)下可伴隨細(xì)菌突破腸黏膜屏障入血進(jìn)入門靜脈系統(tǒng)，通過“肝-腸軸”代謝途徑參與肝細(xì)胞的固有免疫及適應(yīng)性免疫反應(yīng)，并在多種病理微環(huán)境下通過免疫炎癥損傷機(jī)制促進(jìn)肝硬化進(jìn)展及肝細(xì)胞癌的形成，是本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

深入研究腸道細(xì)菌LPS參與肝癌發(fā)生及進(jìn)展的生物學(xué)過程，有助于進(jìn)一步揭示腸道細(xì)菌潛在的致癌機(jī)制，篩選新一代可用于肝癌臨床二級(jí)預(yù)防的生物學(xué)靶點(diǎn)。本文針對(duì)LPS在原發(fā)性肝癌發(fā)生、進(jìn)展與轉(zhuǎn)歸過程中的生物學(xué)功能及致病機(jī)制做了進(jìn)一步分析，為下一步針對(duì)LPS靶點(diǎn)的肝癌防治研究提供借鑒。

1腸道微生物的多態(tài)性變化及腸道屏障功能的減弱是LPS致癌的病理微環(huán)境

1.1 腸道微生物多態(tài)性改變促進(jìn)肝癌的發(fā)生

近年來，腸道細(xì)菌參與包括肝癌在內(nèi)的多種消化道腫瘤致病過程，已被廣泛認(rèn)可^[5-6]，一方面因?yàn)楦咄繙y(cè)序及宏基因組學(xué)技術(shù)的廣泛推廣，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了從基因水平上探究肝癌腸道菌群多態(tài)性。例如，應(yīng)用16s rDNA測(cè)序技術(shù)對(duì)比分析不同階段肝癌、肝硬化及健康人腸道菌群，發(fā)現(xiàn)肝癌組中擬桿菌門的豐度值較對(duì)照組明顯降低，而路氏球菌卻顯著升高達(dá)100倍，這提示包括腸球菌、變形桿菌在內(nèi)的多種細(xì)菌具備作為肝癌無創(chuàng)診斷學(xué)標(biāo)志物的潛力^[7]。同時(shí)提示伴隨肝功能惡化進(jìn)展，韋榮球菌屬同甲胎蛋白呈現(xiàn)正相關(guān)而與罕見小桿菌負(fù)相關(guān)，這表明不同階段菌群的失調(diào)性變化很可能是促使肝硬化向肝癌轉(zhuǎn)化的重要因素之一^[8]。另一方面，受腸道微生物體外培養(yǎng)技術(shù)限制，目前可分離培養(yǎng)的腸道微生物占比尚不足30%，因此臨床應(yīng)用研究進(jìn)展主要集中在腸道菌群重建方面。在動(dòng)物模型中，糞便微生物群移植(FMT)可重建酒精性肝病患者腸道擬桿菌屬缺失，治療脂肪性肝炎、艱難梭菌感染等^[9-10]。在臨床研究中，重建腸道菌群可影響PD-1抑制劑對(duì)肝癌患者的療效^[11]，而且可降低致癌相關(guān)炎性因子IL-6及LPS結(jié)合蛋白的表達(dá)^[12]。研究^[13-14]表明，目前廣泛應(yīng)用于臨床的益生菌不僅有助于調(diào)節(jié)腸道菌群多態(tài)性，嗜乳酸桿菌(L.acidophilus ATCC 4356)表面多糖還可通過抑制多糖相關(guān)固有免疫反應(yīng)TLR2/STAT-3/P38-MAPK途徑從而降低早期致癌風(fēng)險(xiǎn)，是潛在的肝癌二級(jí)預(yù)防用藥^[13-14]。

1.2 LPS是肝臟炎癥損傷及再生修復(fù)過程中重要的誘導(dǎo)因子

生理情況下，腸道微生物群與機(jī)體處于穩(wěn)態(tài)平衡，極少量LPS可突破腸黏膜屏障入血或淋巴管并與高密度脂蛋白HDL3及乳糜微粒相結(jié)合從而最終被肝臟清除，同時(shí)該過程并不顯著引起肝臟固有細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞的免疫炎癥反應(yīng)^[15]。一方面，上述LPS的體循環(huán)過程可造成持久溫和的全身炎性反應(yīng)，研究表明LPS可促進(jìn)肝臟前體蛋白轉(zhuǎn)化酶PCSK9的合成來干預(yù)肝臟脂質(zhì)代謝，上調(diào)的PCSK9水平可與肝細(xì)胞表面低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的受體相結(jié)合來抑制LDL-C的消耗，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化及脂肪肝的形成。同時(shí)高脂血癥及脂肪肝的發(fā)生可進(jìn)一步增加腸黏膜通透性，通過肝腸循環(huán)途徑增加腸源性內(nèi)毒素血癥的風(fēng)險(xiǎn)^[16-17]。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)，一定程度的LPS暴露可對(duì)包括肝纖維化、肝癌在內(nèi)的肝損傷發(fā)揮正向的再生修復(fù)作用，LPS可通過誘導(dǎo)維持肝細(xì)胞的干性表型、促進(jìn)分泌肝細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子及相關(guān)細(xì)胞因子等途徑減輕肝損傷促進(jìn)肝細(xì)胞增殖修復(fù)^[18]。然而，目前可定量干預(yù)腸道微生物L(fēng)PS的技術(shù)手段僅局限于口服益生菌制劑、抗生素等方法，針對(duì)肝癌組織微生物L(fēng)PS的多態(tài)性尚缺乏研究，而目前基于瘤內(nèi)微生物宏蛋白質(zhì)組學(xué)的研究大多集中分類于細(xì)菌門/屬，發(fā)現(xiàn)變形桿菌及厚壁菌作為癌組織微生物的優(yōu)勢(shì)菌群占比70%以上，同時(shí)門分類中革蘭陰性菌的彎曲菌、單胞菌顯著上調(diào)^[19-20]。此類腫瘤組織中極少數(shù)代表性細(xì)菌的LPS多態(tài)性分布及免疫學(xué)機(jī)制值得深入研究。

1.3 腸道屏障功能的減弱是LPS內(nèi)毒素血癥及下游促癌炎癥反應(yīng)的重要條件

眾所周知，腸道屏障由包括腸堿性磷酸酶(IAP)、黏液層、腸上皮細(xì)胞及固有免疫層在內(nèi)的四部分構(gòu)成^[21]。生理狀態(tài)下，肝臟通過門靜脈系統(tǒng)接受源于胃腸道75%的血供，同時(shí)在腸道屏障多重結(jié)構(gòu)的保護(hù)下，極少的腸道細(xì)菌及其病原相關(guān)模式分子(PAMP)通過體循環(huán)入肝臟。然而在肝癌及肝硬化等狀態(tài)下，IAP對(duì)腸道細(xì)菌LPS類脂A結(jié)構(gòu)的去磷酸化作用減弱^[22]，同時(shí)由于上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步破壞，未經(jīng)IAP去磷酸化作用減毒的LPS及其他PAMP可順勢(shì)突破腸道屏障進(jìn)入體循環(huán)毛細(xì)血管中與LPS結(jié)合蛋白及其他脂蛋白相結(jié)合，進(jìn)而形成門靜脈LPS內(nèi)毒素血癥^[21-23]。

根據(jù)Marshall在1998年提出的“肝-腸軸”理論，肝臟作為首個(gè)經(jīng)門靜脈接觸腸源細(xì)菌內(nèi)毒素及其他PAMP的消化腺，其Kupffer細(xì)胞、肝細(xì)胞及星狀細(xì)胞可被動(dòng)員并激活下游一系列固有及適應(yīng)性免疫炎癥反應(yīng)從而損傷肝臟，同時(shí)肝臟炎性損傷可反向下調(diào)腸道的生理功能。近年來多項(xiàng)動(dòng)物模型研究表明，上述慢性肝臟炎癥損傷-修復(fù)機(jī)制顯著促進(jìn)了肝癌的發(fā)生，參與肝癌的進(jìn)展過程^[24]。然而，由于腸道革蘭陰性細(xì)菌體外培養(yǎng)技術(shù)限制、LPS致癌機(jī)制復(fù)雜等原因，目前基于臨床的菌群致癌機(jī)制研究有限，需要進(jìn)一步深入探究。

2LPS相關(guān)免疫反應(yīng)是腸道菌群致癌的核心機(jī)制

2.1 腸道細(xì)菌通過LPS-Toll樣受體(TLR)途徑引發(fā)下游炎癥反應(yīng)，參與肝癌的發(fā)生與進(jìn)展

在肝硬化、肝癌等病理情況下，多態(tài)性改變的腸道微生物群與減弱的腸屏障相互作用，使大量未經(jīng)IAP充分脫磷酸失活的LPS經(jīng)門靜脈入肝，并在CD14的輔助下通過Lipid A結(jié)構(gòu)與Kupffer細(xì)胞表面的TLR家族成員TLR4結(jié)合，通過髓樣分化初級(jí)反應(yīng)蛋白(MyD-88)依賴及非依賴途徑激活下游NF-κB、STAT-3通路，從而刺激細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17等的產(chǎn)生，進(jìn)而通過慢性炎癥損傷-修復(fù)機(jī)制促進(jìn)肝癌的發(fā)生^[24-25]。在動(dòng)物模型中，經(jīng)化學(xué)法誘發(fā)的肝癌小鼠經(jīng)抗生素?zé)o菌化處理后，可明顯降低肝癌發(fā)生率及局部腫塊大小，并通過LPS-TLR4途徑下調(diào)多個(gè)細(xì)胞因子的表達(dá)，反向驗(yàn)證LPS抑制細(xì)胞凋亡的同時(shí)降低細(xì)胞對(duì)活性氧(ROS)的敏感性，也說明了腸道細(xì)菌確實(shí)參與肝癌的發(fā)生過程^[26]。不僅如此，研究^[27]表明LPS-TLR4途徑深度參與晚期肝癌的轉(zhuǎn)歸過程，而在肝癌早期LPS主要通過MyD-88非依賴旁分泌方式，上調(diào)肝星狀細(xì)胞分泌表皮調(diào)節(jié)素從而促進(jìn)肝癌的進(jìn)展，說明腸道細(xì)菌LPS-TLR4途徑很可能是臨床晚期肝癌治療藥物的全新干預(yù)靶點(diǎn)。但遺憾的是，目前臨床針對(duì)腸道細(xì)菌LPS-TLR4途徑仍以間接性單用或聯(lián)合抗生素如利福昔明、多黏菌素B等干預(yù)治療為主，尚缺乏可用于人體的直接針對(duì)性靶向阻斷劑^[28-30]。

2.2 細(xì)胞因子介導(dǎo)免疫信號(hào)通路是LPS介導(dǎo)肝癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的核心分子途徑

LPS-TLR4激活下游NF-κB通路產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子具有不同的信號(hào)功能，依據(jù)經(jīng)典的“多重打擊”理論，細(xì)胞因子IL-1β介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞的免疫損傷及TNF-α與對(duì)肝細(xì)胞的直接殺傷作用，均被認(rèn)為是固有免疫對(duì)肝細(xì)胞的第一重打擊^[31]。然而肝細(xì)胞癌的發(fā)生及進(jìn)展過程除上述免疫損傷外，還伴隨著長(zhǎng)久的慢性再生-修復(fù)過程，例如IL-6可激活下游JAK/STAT-3途徑，通過失活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspases)、下調(diào)ROS來抑制Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮對(duì)肝細(xì)胞的再生修復(fù)作用^[32-33]。不僅如此，在晚期肝癌的小鼠模型中，LPS-TLR4途徑被證實(shí)可上調(diào)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)家族成員肝臟絲裂原的產(chǎn)生，從而動(dòng)員EGFR、HER2受體參與晚期肝癌的進(jìn)展過程^[27]。另外，隨著肝癌進(jìn)展至不同階段，腫瘤微環(huán)境的變化伴隨不同的免疫反應(yīng)，LPS-TLR4途徑的激活可動(dòng)員巨噬細(xì)胞分泌IL-10及趨化因子CCL22，CCL22可正向募集調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(FOXP3⁺Treg)向腫瘤細(xì)胞聚集，同時(shí)IL-10負(fù)向調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對(duì)TNF-α、IL-2等的敏感性，而上述變化的微環(huán)境加速了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，進(jìn)而形成肝內(nèi)轉(zhuǎn)移^[34-35]。

3針對(duì)“LPS-TLR4”途徑的干預(yù)是肝癌“靶向治療”的全新發(fā)展方向之一

因腸道菌群基因組龐大及分子水平研究技術(shù)限制，傳統(tǒng)針對(duì)肝癌腸道細(xì)菌LPS的抗腫瘤治療方案大多是以抗生素、FMT及益生菌為代表，通過平衡菌群多態(tài)性、修復(fù)腸屏障功能來改善門靜脈內(nèi)毒素血癥，從而間接下調(diào)包含TLR4在內(nèi)LPS配體介導(dǎo)的下游炎癥反應(yīng)。近年來隨著高通量測(cè)序、基因編輯及分子靶向技術(shù)的進(jìn)展，研究者^[36]發(fā)現(xiàn)CRISPR技術(shù)已在治療酒精性肝損傷獲益方面被證實(shí)遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)FMT，具備極大潛力用于治療肝癌免疫性損傷。隨著LPS的合成通路逐漸被研究者揭開，發(fā)現(xiàn)LpxC是Lipd A合成通路中第一個(gè)關(guān)鍵酶，合成可強(qiáng)效抑制LpxC酶的新型化合物分子LPC-011等從而實(shí)現(xiàn)化學(xué)法敲除LPS，為下一步在動(dòng)物模型上研究LPS在肝癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)歸過程中的免疫學(xué)作用及LPS在局部腫瘤內(nèi)外微環(huán)境中的生物學(xué)作用提供了全新的技術(shù)工具^[37]。另一方面，研究者針對(duì)LPS受體TLR4設(shè)計(jì)了小分子化合物TAK-242，能夠在不影響LPS與巨噬細(xì)胞結(jié)合的情況下抑制下游多種細(xì)胞因子及一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，是潛在可用于治療進(jìn)展型肝癌的候選靶向藥物，同時(shí)為進(jìn)一步研究細(xì)胞因子炎癥反應(yīng)在癌癥不同階段的損傷-修復(fù)機(jī)制提供新思路^[38-39]。除上述人工合成小分子外，據(jù)報(bào)道一類天然海洋真菌提取吲哚生物堿——新棘菊素A(Neoechinulin A)可劑量依賴性抑制IκB-α的磷酸化降解從而抑制LPS-TLR4途徑下游NF-κB及p38 MAPK通路，下調(diào)致癌相關(guān)性炎癥反應(yīng)^[40-41]。目前，新棘菊素A已被證實(shí)可有效抑制神經(jīng)性炎癥反應(yīng)，但在包括肝癌在內(nèi)的惡性腫瘤中的抑癌機(jī)制仍缺乏進(jìn)一步研究，很可能是一種針對(duì)LPS-TLR4/NF-κB通路的潛在新型靶向抗腫瘤藥物^[40]。隨著細(xì)菌LPS致癌機(jī)制的揭示，未來基于腸道細(xì)菌LPS-TLR4通路的“靶向”藥物具有極大的發(fā)展?jié)摿ΓS著脂蛋白結(jié)合藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的成熟，未來基于LPS-TLR4靶點(diǎn)的藥物遞送系統(tǒng)可更加精準(zhǔn)的發(fā)揮抗腫瘤作用，是臨床“靶向”精準(zhǔn)治療的熱門發(fā)展方向^[42]。

4結(jié)語(yǔ)及展望

近年來隨著肝癌致病機(jī)制不斷被揭示，明確了腸道微生物在肝癌致病過程中具有重要的生物學(xué)地位，很可能是除病毒性肝炎、酒精/非酒精性脂肪肝、糖尿病及其他代謝綜合征之外的另一大關(guān)鍵性危險(xiǎn)因素^[43]；發(fā)現(xiàn)了腸道微生物多態(tài)性分析可作為肝癌早期篩查的無創(chuàng)性生物標(biāo)志物^[6]；證明了腸道細(xì)菌LPS相關(guān)性炎癥反應(yīng)參與肝癌的發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸過程(圖1)。目前肝癌非手術(shù)治療手段有限，以免疫檢查點(diǎn)抑制劑、酪氨酸激酶受體拮抗劑及表皮生長(zhǎng)因子受體拮抗劑為代表的系統(tǒng)性治療藥物面臨基因突變耐藥、對(duì)應(yīng)腫瘤分期嚴(yán)格等限制條件下，因此研制新型作用于LPS-TLR4靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物尤為重要。

圖1 腸道微生物L(fēng)PS致癌機(jī)制

需要指出的是，雖然TLR4是細(xì)菌LPS激動(dòng)的主要受體，但仍不排除其他Toll受體家族成員被LPS激動(dòng)引發(fā)旁路致癌途徑，并且不同細(xì)菌屬的LPS結(jié)構(gòu)不盡相同^[24]，特定代表性細(xì)菌如大腸埃希菌(E. coli) 應(yīng)致癌的具體機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。另一等的O抗原、Lipid A結(jié)構(gòu)激動(dòng)肝固有及適應(yīng)性免疫反方面，除革蘭陰性菌外，腸道革蘭陽(yáng)性菌的胞壁酸結(jié)構(gòu)是TLR2的配體^[13]，可與膽汁酸的初-次級(jí)代謝過程協(xié)同造成肝細(xì)胞DNA的損傷，形成肝星狀細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型，而促進(jìn)肝癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移^[13-44]。

綜上所述，現(xiàn)有腸道細(xì)菌LPS與肝癌致病機(jī)制研究主要集中在動(dòng)物模型，對(duì)臨床應(yīng)用研究有限。下一步，以下幾方面將是今后臨床研究的重要方向：(1)提取特定代表性細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)組分并體內(nèi)驗(yàn)證其交叉致癌效應(yīng)；(2)研制LPS作為潛在免疫佐劑的藥物靶向遞送系統(tǒng)；(3)針對(duì)性合成或提取高效的靶點(diǎn)抑制劑。