一、CCK-8 簡介

Cell Counting Kit-8 (CCK-8)：一種基于 WST-8 用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測的試劑盒。

用途：藥物篩選、細(xì)胞增殖測定、細(xì)胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗

CCK-8 試劑中含有 WST-8 【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2, 4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，是一種類似于 MTT 的的化合物，它在電子耦合試劑 1-Methoxy PMS 存在條件下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物 Formazan，生成的 Formazan 數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進行細(xì)胞增殖和毒性分析，細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。

常用毒性/增殖試劑比較如下：

二、操作步驟

1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（測定細(xì)胞具體數(shù)量時）

1）制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計數(shù)。

2）接種到 96 孔板中：按比例（例如 1/2 比例）依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細(xì)胞濃度梯度，一般要 3-5 個細(xì)胞濃度梯度，每組 3-6 個重復(fù)孔。每孔約 100 μL 細(xì)胞懸液。

3）37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng) 2-4 h， 如果不需要貼壁， 這步可以省去。

4）每孔加入 10 μL CCK-8 增強型溶液：由于每孔加入 CCK-8 量比較少，有可能因試劑粘在孔壁帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻?；蛘咧苯优渲煤?10% CCK-8 的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。注意不要在孔中生成氣泡，以免影響吸光度的檢測。

5）培養(yǎng)箱內(nèi)孵育一定時間后測定 450 nm 吸光度，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)（X 軸），吸光度為縱坐標(biāo)（Y 軸）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量（使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實驗的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入 CCK-8 后的培養(yǎng)時間。）

2 細(xì)胞活性檢測

1）制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計數(shù)。

2）接種到 96 孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)，每孔加入 10 μL 細(xì)胞懸液，可設(shè)置 3 個重復(fù)孔。

3）37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要 2-4 h，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4）每孔加入 10 μL CCK-8 增強型溶液：由于每孔加入 CCK-8 量比較少，有可能因試劑粘在孔壁帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻?；蛘咧苯优渲煤?10% CCK-8 的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。注意不要形成氣泡，以免影響光度的檢測。

5）培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 0.5-4 h：細(xì)胞種類不同，形成的 Formazan 的量也不一樣，對于大多數(shù)情況孵育 1 h 即可。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確定最佳條件。特別是血液細(xì)胞形成的 Formazan 很少，需要較長的顯色時間（5-6 h）。

6）測定 450 nm 吸光度：如果暫時不測定吸光度，可以向每孔中加入 10 μL CCK-8 反應(yīng)終止液，遮蓋培養(yǎng)板避光保存在 2-8℃， 在 7 天內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化；或者可以向每孔加入 10 μL 自己配置的 0.1 M HCl 溶液或 1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下，在 20 h 內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

3 細(xì)胞增殖-毒性檢測

1）制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計數(shù)。

2）接種到 96 孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)，每孔約 100 μL 細(xì)胞懸液，可設(shè)置 3 個重復(fù)孔。

3）37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng) 2-4 h，如果不需要貼壁，這步可以省去。也可以根據(jù)實驗要求的不同，培養(yǎng)相應(yīng)的時間。

4）每孔加入 0-10 μL 不同濃度的待測藥物。

5）37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：加入待測藥物的培養(yǎng)時間，要看該物質(zhì)的性質(zhì)和細(xì)胞的敏感性，一般要根據(jù)細(xì)胞周期來決定，起碼要一代以上的時間。

6）每孔加入 10 μL CCK-8 增強型溶液：由于每孔加入 CCK-8 量比較少，有可能因試劑粘在孔壁帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。或者直接配置含 10% CCK-8 的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。注意不要在孔中生成氣泡，以免影響吸光度的檢測。

（注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可以加 CCK-8 之前除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基，以去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。）

7）培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 0.5-4 h：細(xì)胞種類不同，形成的 Formazan 的量也不一樣，對于大多數(shù)情況孵育 1 h 即可。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確定最佳條件。特別是血液細(xì)胞形成的 Formazan 很少，需要較長的顯色時間（5-6 h）。

8）測定 450 nm 吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長 450-490 nm，參比波長 600-650 nm。如果暫時不測定吸光度，可以向每孔中加入 10 μL CCK-8 反應(yīng)終止液，遮蓋培養(yǎng)板避光保存在 2-8℃， 在 7 天內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化；或者可以向每孔加入 10 μL 自己配置的 0.1 M HCl 溶液或 1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下，在 20 h 內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

4 計算公式

細(xì)胞存活率 = [ (As - Ab) / (Ac - Ab) ] × 100%

細(xì)胞存活率 = [ (Ac - As) / (Ac - Ab) ] × 100%

As: 實驗孔（含有細(xì)胞培養(yǎng)基、 CCK-8、 待測藥物）的吸光度

Ac: 對照孔（含有細(xì)胞培養(yǎng)基、 CCK-8、 沒有待測藥物）的吸光度

Ab: 空白孔（不含細(xì)胞和待測藥物的培養(yǎng)基、 CCK-8）的吸光度

5 注意事項

1）建議先做幾個孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入 CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時間。

2）CCK-8 反應(yīng)時間的確定：一般情況下，白細(xì)胞顯色比較困難，因此需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長 CCK-8 反應(yīng)時間。懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難顯色，因此懸浮細(xì)胞在加入 CCK-8 培養(yǎng) 0.5-4 h 后，可先從培養(yǎng)箱取出，目測或用酶標(biāo)儀測定顯色程度，若顯色困難可以繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時后再確定。對于貼壁細(xì)胞，CCK-8 的培養(yǎng)時間一般為 0.5-4 h，在培養(yǎng) 20 min 左右可以取出肉眼觀察顯色程度。

3）每孔接種細(xì)胞數(shù)：當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn) 96 孔板時，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為 1000 個/孔（100 μL 培養(yǎng)基）。如果要使用 24 孔板或 6 孔板實驗，請先計算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的 10% 加入 CCK-8 溶液。

4）設(shè)置空白對照：在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入 CCK-8，培養(yǎng)一定的時間，測定 450 nm 的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗（細(xì)胞毒性實驗）時，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養(yǎng)基中加入 CCK-8，培養(yǎng)一定的時間，測定 450 nm 的吸光度作為空白對照。

5）影響 CCK-8 測定的物質(zhì)：由于 CCK-8 檢測細(xì)胞活性的原理是通過檢測活細(xì)胞脫氫酶催化的反應(yīng)，所以如果待測體系中存在氧化還原物質(zhì)則可能會干擾檢測結(jié)果，還原物質(zhì)會使吸光度增加，氧化性物質(zhì)會使吸光度減小，因此應(yīng)需設(shè)法去除這些物質(zhì)的影響。酚紅和血清對本試劑盒的測定無明顯影響，培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除只含有培養(yǎng)基的對照孔中本底吸光度而清除，因此不會對檢測結(jié)果造成影響。

6）測定波長：如果樣品為高渾濁的細(xì)胞懸液，建議采用雙波長進行測定，檢測波長 450 nm，參比波長 600-650 nm。如果沒有 450 nm 的濾光片，可以使用吸光度在 430-490 nm 之間的濾光片，但是 450 檢測靈敏度最高。

7）當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為檢測孔用。

8）如果細(xì)胞培養(yǎng)時間較長，培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，應(yīng)洗滌細(xì)胞更換培養(yǎng)基后再加 CCK-8 檢測。

9）CCK-8 保存條件：4℃ 避光保存，一年有效。- 20℃ 保存，兩年有效。但反復(fù)凍融會增加背景值，干擾實驗測定，因此請將經(jīng)常使用的試劑保存在4℃。

參考

[1]     Wuhan kerui Biotechnology Co., Ltd.