Q1: 一個孔中應接種多少個細胞？

A1: 當使用標準96孔板時，貼壁細胞

的最小接種量至少為1,000 個/孔 (100μl 培養(yǎng)基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100μl 培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

Q2: 能否用384孔板進行試驗

A2:可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8體積太少，可以先將CCK-8溶液稀釋1倍，然后加入培養(yǎng)基體積20%的量。

Q3: 能否用24孔板進行試驗

A3: 可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液。

Q4: 酚紅會影響檢測嗎？

A4: 不會。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

Q5:CCK-8與胸苷結合檢測之間是否有相關性

A5: 有。然而，請注意由于CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同，因此結果可能不同。

Q6: CCK-8能否檢測細菌細胞？

A6: 可以檢測E.coli，但不能檢測酵母細胞。向100μl E.coli培養(yǎng)液中加入10μl CCK-8溶液，并培養(yǎng)1-4個小時或過夜。

Q7: CCK-8穩(wěn)定嗎？

A7:CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要長期保存，我們推薦-20℃的儲藏條件。

Q8: 如果沒有450 nm的濾光片，還可以使用哪些其他濾光片？

A8: 還可使用450 nm到490 nm之間的濾光片。

Q9: 如何減少由于CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的誤差？

A9: 可以在加樣前用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑并混勻后加樣

Q10: CCK-8是什么顏色？

A10: 應該是粉紅色。若顏色不一樣，有可能會影響測定。

Q11: CCK-8能否對活細胞進行染色？

A11：不能。因為CCK-8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽 (WST-8)，并通過電子載體PMS將活細胞中的電子交換到培養(yǎng)基中的WST8上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK-8不能對細胞進行染色。

Q12: CCK-8檢測溶液對細胞是否有毒？

A12: CCK-8溶液自身因為高濃度的PMS的存在而具有一點毒性。但是，加到培養(yǎng)基中的CCK-8是沒有毒性的，因為被稀釋了10倍。因此，長時間的培養(yǎng)，如過夜或者培養(yǎng)數(shù)天是可以的。同一個細胞培養(yǎng)液在CCK-8檢測后還可以用于其他細胞增殖檢測，如結晶紫檢測，中性紅檢測或者DNA熒光檢測等。由于每種細胞對于CCK-8的耐受力都不同，因此在需要進行長時間培養(yǎng)時，先檢測一下細胞在加入CCK-8培養(yǎng)后的活力

Q13: 在做加藥實驗時，藥物對測定是否有影響？如何解決？

A13:有時會有影響。如果藥物具有還原性，會和CCK8發(fā)生顯色反應，增加吸光度。解決辦法：首先要確認藥物是否有吸收，在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，測定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基 (加CCK-8)的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK-8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。

Q14: 每次測定的數(shù)值不一樣，是什么原因？如何解決？

A14: 可能會有以下幾個原因：1. 當在培養(yǎng)箱內培養(yǎng)時，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。2. 有可能會因為CCK-8沾在壁上而產生誤差，建議在加入CCK-8后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。3. 每孔的細胞數(shù)量過多或過少。請預先在1,000-100,000個/孔范圍內摸索條件。

Q15: 如何設定空白對照？

A15: 在不含細胞的培養(yǎng)基中加入CCK-8，培養(yǎng)一定的時間，測定450nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗(細胞毒性實驗)時，還應考慮藥物的吸收，可在不含細胞，加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，培養(yǎng)一定的時間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。

Q16: 哪些物質會影響CCK8的測定？

A16: 當有還原性物質存在時會影響CCK-8的測定，例如含有維生素C的Glucose等 (一般培養(yǎng)基中的量不多，酚紅或血清不影響測定)。在有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收，但不影響測定，扣除空白吸收即可。

Q17: 在實驗中吸光度值太高，如果不能減少細胞數(shù)量，如何解決？

A17: 可以縮短加入CCK-8后的培養(yǎng)時間。例如: 可以把加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時間由2小時縮短為1小時。

Q18: 設定參比波長的目的是什么？必須設定嗎？

A18: 不一定要設定。CCK-8試劑在參比波長沒有吸光度。設定參比波長的目的是為了取出由于樣品混濁所帶來的吸收。

Q19: 說明書上僅寫了96孔板的測定方法.如果使用24孔板或12孔板，應該加多少量CCK-8試劑？

A19: 一般情況下建議加入CCK-8試劑的量是培養(yǎng)基體積的1/10.

Q20: 在CCK-8顯色過程中，如何終止反應？

A20: 有以下幾種方法（96孔板）：①在顯色反應后，將培養(yǎng)板放置4℃冰箱內。②每孔加10μl 0.1 MHCL溶液。③每孔加10μl的 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液。注意：反應停止后，應在24小時之內測定。

Q21: 必須預培養(yǎng)細胞嗎？

A21: 不一定。如果要向保持細胞的最好狀態(tài)，建議預培養(yǎng)細胞。如果不做細胞預培養(yǎng) ，細胞內的脫氫酶可能會不穩(wěn)定。也有人不做細胞預培養(yǎng)，但在做標準曲線和檢測時需要統(tǒng)一檢測條件。

Q22: 如果加入的藥物中含有金屬，是否會有影響？

A22: 金屬對CCK-8顯色有影響。當終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應，使靈敏度降級。如果終濃度是10 Mm的話，將會100%抑制。

Q23: CCK-8試劑的保存條件？

A23:在避光條件下CCK-8試劑在4℃可保存一年。如果需要保存較長時間的話，推薦在-20℃下保存。但是CCK-8若反復解凍和冰凍將會增加空白吸收，從而影響檢測結果，若經(jīng)常使用可將試劑存放在4℃冰箱內保存。

Q24: 預培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基需要細胞計數(shù)嗎？

A24: 一般情況下用胰蛋白酶處理對數(shù)增長期的細胞，用血球計數(shù)盤計數(shù)，制備成一定濃度的細胞懸液即可。如果想要精密計數(shù)細胞的話，可以預培養(yǎng)后取培養(yǎng)基用血球計數(shù)盤進行計數(shù)。

Q25: CCK-8對于不同的細胞，靈敏度是否一樣？

A25: 不一樣，懸浮細胞與貼壁細胞相比較難染色。對于貼壁細胞，一般加入CCK-8培養(yǎng)1-4小時吸光度已經(jīng)很高，但對于懸浮細胞則可能吸光度較低，可以通過延長CCK-8的加入時間或增加細胞數(shù)量來解決。

Q26:懸浮細胞和貼壁細胞在數(shù)量上有何區(qū)別？

A26:懸浮細胞由于染色比較困那，一般需要增加細胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時間。貼壁細胞染色比較容易，若細胞數(shù)量過大，有時吸光度會超過酶標儀的讀數(shù)。

Q27: 應該每次做標準曲線嗎？

A27: 建議每次做。雖然細胞是一樣的，但是細胞的狀態(tài)不一定一樣，對于狀態(tài)不一樣的細胞，建議每次做標準曲線。如果試劑的批號不一樣，靈敏度可能會有輕微的差異，對于不同的批號建議分別做標準曲線。

Q28: 有時在藥物作用情況下，細胞已經(jīng)死亡，但是脫氫酶的活性還在，是否能計算細胞數(shù)量？

A28: 不能。由于CCK-8是通過和細胞內的脫氫酶進行反應間接反映活細胞數(shù)量，如果細胞已經(jīng)死亡，但脫氫酶的活性還在，則試劑測定的細胞數(shù)量將會比真實值高，不能真實反映活細胞數(shù)量，建議采用別的方法測定。

Q29: 實驗之前，是否需要先檢測一下培養(yǎng)基和CCK-8是否會反應？

A29: 需要，可用一個孔檢測一下，因為有培養(yǎng)基中可能含有氧化還原反應的物質，在正式實驗之前有必要先確認培養(yǎng)基和CCK-8是否反應。一般正常在的OD值應該在0.4以下。

Q30: 如果OD值太低，可以采取什么辦法？

A30: 可以采取2個辦法：① 適當增加細胞數(shù)量。② 延長加入CCK-8試劑后的染色時間。