復雜腸道微生物組的設計、構建和體內強化

Design, construction, and in vivo augmentation of a complex gut microbiome

Resource, 2022-09-15, Cell, [IF 64.5]

DOI：10.1016/j.cell.2022.08.003

原文鏈接：https://www./science/article/pii/S0092867422009904

第一作者：Alice G. Cheng

通訊作者：Alice G. Cheng, Kerwyn Casey Huang, Michael A. Fischbach

主要單位：

斯坦福大學醫(yī)學院胃腸病學和肝病科

斯坦福大學生物工程系

舊金山Chan Zuckerberg生物中心

斯坦福大學ChEM-H研究所

斯坦福大學醫(yī)學院微生物學和免疫學系

勞倫斯伯克利國家實驗室，環(huán)境基因組學和系統(tǒng)生物學部

加州大學伯克利分校植物與微生物生物學系

• 介紹了一個由104種腸道細菌組成的特定菌群hCom1；

• 在體內填充開放的生態(tài)位形成了hCom2（一個由119個物種組成的特定菌群）；

• 在非生物小鼠中，hCom2對大腸桿菌表現(xiàn)出強大的定殖抗性；

• hCom2定殖小鼠與人類糞便菌群定殖小鼠表型相似。

在小鼠中模擬人類腸道微生物組的研究揭示了宿主-微生物相互作用機制。然而，迄今為止所研究的菌群模型只具備“明確”或“復雜”一個特征，這限制了它們的實用性。在這里，作者在體外構建并表征了由104種細菌組成的確定菌群（hCom1），這些細菌由人類腸道微生物組中最常見的分類群組成。然后，使用了一個迭代的實驗過程來填充開放的生態(tài)位：用hCom1定殖無菌小鼠，然后用人類糞便樣本移植。作者發(fā)現(xiàn)了在糞便處理后定殖的新物種，并將它們添加到hCom1中，作為hCom2。在無菌小鼠中，hCom2對糞便的移植表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性和對致病性大腸桿菌的強大定殖抗性。hCom2定殖小鼠與人類糞便菌群定殖小鼠表型相似，表明該菌群將為研究微生物組中相關表型與物種、基因之間的機制成為可能。

將微生物組移植到無菌小鼠體內的實驗為研究微生物組的機制和因果關系打開了大門。這些研究根據移植菌群的性質分為兩類：完整的、不確定的菌群（即糞便樣本）和不完整但確定的菌群（即合成菌群）。糞便移植研究表明，微生物組在多種宿主表型中發(fā)揮作用，包括對癌癥免疫治療的反應，熱量獲取，對腸道病原體的定殖抗性和神經發(fā)育。盡管這些研究具有啟發(fā)性，但這種研究模式的一個局限性是難以對菌群中的微生物進行“分餾（fractionate）”，這使得發(fā)現(xiàn)哪些物種參與感興趣的表型具有挑戰(zhàn)性。

作為腸道微生物組的模型系統(tǒng)，合成菌群發(fā)展得不太好。開創(chuàng)性的研究表明，一個合成菌群可以模擬飲食對微生物組的影響，在15個成員的菌群存在的情況下，確定了擬桿菌在小鼠腸道中生長所需的基因，并證明了由單一供體分離的物種組成復雜的菌群可以穩(wěn)定地定殖在小鼠體內。最近的研究揭示了免疫調節(jié)、多糖消耗和其他由微生物組驅動的復雜表型的機制。盡管合成菌群能夠被精確控制和操作，如菌株去除和基因敲除，但所使用的菌群通常復雜性較低（20株），限制了它們模擬原生微生物組生物學的能力。

一個理想的腸道微生物組模型系統(tǒng)可以捕捉到這兩種方法的優(yōu)點：接近原生的復雜性將使模型微生物組能捕捉到生態(tài)系統(tǒng)中簡單模型系統(tǒng)缺少的特性，包括涌現(xiàn)特征如對擾動的恢復能力和合作代謝等。此外，復雜合成菌群是腸道微生物組體內研究的一個有希望的起點，因為它們更適合于模擬菌群水平的現(xiàn)象，如免疫調節(jié)和多物種生物膜的形成。

完全明確的菌群（即完全由已知生物組成的菌群）將使還原論實驗能夠探索機制。構建具有確定組成的菌群的能力在實驗測試是否可以通過糞便移植將表型轉移到無菌小鼠的背景下尤為重要。目前，由于移植菌群通常是不確定的，因此很難揭示這些現(xiàn)象背后的機制。一個足夠復雜的模型系統(tǒng)將使還原論的后續(xù)實驗成為可能，使腸道微生物組與其他模型系統(tǒng)保持一致，從而使機制研究成為可能。

因此，作者試圖創(chuàng)建一個明確的、能夠精確操作的、足夠復雜的菌群，以展示一個完整菌群的新特征，如移植時的穩(wěn)定性和定殖抗性。作者首先構建了一個復雜的特定菌群，其中包含了人類腸道微生物組中最常見的細菌物種（hCom1）。作者證明，104個成員的菌群是可重復的，盡管存在非常低豐度的物種。通過系統(tǒng)地干擾該菌群及其生長介質，作者發(fā)現(xiàn)了構成其組成的菌株-營養(yǎng)物和菌株-菌株（如，共生）相互作用。然后，作者用hCom1定殖無菌小鼠，表明hCom1是穩(wěn)定的，高度可重復的，并且其組成物種的相對豐度跨越了六個數(shù)量級。作者通過使用一個迭代的、基于生態(tài)的過程填充開放的生態(tài)位來強化擴充菌群，并表明強化后的菌群（hCom2）有更強的抗擾動能力和更高的對病原體定殖抵抗力。最后，證明了hCom2定殖小鼠在表型上與人類糞便移植小鼠相似，這表明合成菌群構建和強化過程為開發(fā)完整的、明確的人類腸道微生物組模型奠定了基礎。

圖1 一個復雜的腸道細菌菌群。

（A）基于保守單拷貝基因多序列比對的104株hCom1的系統(tǒng)發(fā)育樹。該菌群是通過識別來自NIH人類微生物組計劃（HMP）的測序數(shù)據中最流行的菌株來設計的（厚壁菌門，紅色；放線菌門，藍色；疣微菌門，橙色；擬桿菌門，綠；變形菌門，紫色）。還顯示了HMP數(shù)據集中每種菌株的流行率和相對豐度（n = 81, 流行率指檢測到該菌株的受試者比例），白線表示每個菌株在受試者之間的分布的log₁₀(relative abundance)平均值。盡管在HMP樣本中流行率較低，但仍將Ruminococcus bromii ATCC 27255和Clostridium sporogenes ATCC 15579加入到菌群中；

（B）菌群快速達到穩(wěn)定狀態(tài)。在SAAC培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng)，檢驗其組成的穩(wěn)定性。每個點都是一個單獨的菌株；每列所有點的集合表示在該時間點的菌群組成。到12 h時，菌群中菌株的相對豐度跨越了6個數(shù)量級，并在48 h內基本保持穩(wěn)定（根據菌株在48小時的豐度進行著色）；

（C）在不同時間制備的兩種菌群（即生物重復）在48 h時產生的菌群結構相似；

（D）由相同接種物（技術重復）產生的菌群在48 h時具有幾乎相同的組成。（C）和（D） 中，圓點顏色代表相應物種的門，灰色輪廓和淺色表示該菌株存在是由錯誤匹配。

首先通過在體外多次構建和培養(yǎng)104個成員的菌群，來測量菌群組成數(shù)據的可重復性。采用技術重復來評估細菌生長、DNA提取和測序的變化，并采用生物重復來確定接種劑制備差異的影響。繁殖48 h，并在0、12、24和48 h提取DNA進行測序。

t = 0時的細胞密度范圍跨越多個數(shù)量級（圖1B），所有可檢測菌株的平均log₁₀(相對豐度)為?2.5 ± 0.8。t = 0時，95/104株檢出；剩下的菌株在單獨培養(yǎng)時生長不良，低于檢測極限或豐度可能由讀序錯誤比對來解釋。菌群在12小時內達到相對穩(wěn)定的結構（圖1B），在生物重復中具有顯著的可重復性（圖1C）。值得注意的是，非常低豐度的菌株（< 10^?4）只比高豐度的菌株稍微多一些變化。技術上的重復甚至更加相似（圖1D），表明菌群生長、DNA提取和測序對變異的貢獻很小。綜上所述，這些結果表明菌群組成對實驗變化具有魯棒性。

接下來，作者試圖探索菌群中菌株-營養(yǎng)相互作用的網絡。人們對腸道共生菌的多糖攝取了解很多，但對氨基酸利用的了解卻很少；因此，作者在一種確定的生長培養(yǎng)基（標準氨基酸完全培養(yǎng)基[SAAC]）中進行了實驗，每次可以從中去除一個氨基酸。由于氨基酸通常成對使用，從完整背景中一次刪除一個而不是一次添加一個到空背景中，更有可能揭示與菌群功能相關的表型。此外，在一個多樣化的菌群背景下進行這種篩選（與分析分離菌株生長的傳統(tǒng)做法相反），可以研究菌群依賴效應，如養(yǎng)分競爭或相互依賴的養(yǎng)分利用。

為了繪制菌株與氨基酸的相互作用圖，作者構建了104個成員的菌群，并用它接種20種確定的生長培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基缺乏一種氨基酸，以及完整的SAAC（圖2A）。48 h采集樣本，分析宏基因組測序數(shù)據，以確定氨基酸缺乏對每個菌株相對豐度的影響。

圖2 菌株與氨基酸相互作用的系統(tǒng)分析。

（A）氨基酸去除實驗示意圖。104株的冷凍存儲菌株用于培養(yǎng)物接種，培養(yǎng)24小時后稀釋到（盡可能）相似的光密度并混合，將混合菌群置于不同單一氨基酸缺失的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以SAAC培養(yǎng)基為對照。48 h后，用NinjaMap對菌群進行測序和分析，以確定缺失不同氨基酸對各細菌生長的影響；

（B）氨基酸缺失對菌群組成的影響。每個點都是一個單獨的菌株，每一列表示該時間點的菌群組成。菌株根據其在完全培養(yǎng)基（SAAC）中生長的菌群中的相對豐度著色。同一樣品中，相對豐度通過從更豐富的菌株中序列錯誤比對來解釋的菌株用灰色輪廓繪制，未檢測到的菌株設置為10^?7以便可視化；

（C）熱圖顯示了每個菌株（x軸）在氨基酸缺失（y軸）上的分層聚類（Z score，根據除半胱氨酸缺失外所有樣品中菌株豐度的標準差計算）。厚壁菌門中L. lactis，C. sporogenes和L. ruminis在缺乏亮氨酸和異亮氨酸的條件下生長較弱。那些豐度可以通過高豐度菌株的錯誤比對來解釋的菌株沒有顯示出來；

（D）氨基酸去除的效果因氨基酸而異。繪制了不同氨基酸缺失影響下|Z|＞2的菌株 （n = 66）。

（E）亮氨酸或精氨酸的缺乏導致C. sporogenes相對豐度的大幅下降。菌株根據其在完全培養(yǎng)基中生長的相對豐度著色。僅在三個樣品中至少有一個樣品檢測到的菌株被納入（n = 92）。C. sporogenes用黑色突出顯示，L. lactis以白色突出顯示。未檢測到的菌株設置為10?7以便可視化；

（F）C. sporogenes在完全培養(yǎng)基中的生長依賴于精氨酸的存在，而鳥氨酸轉氨基甲酰基酶（otc）部分負責精氨酸的代謝。野生型C. sporogenes和Δotc突變體在完全培養(yǎng)基（添加/不添加精氨酸）中培養(yǎng)。生長曲線描繪了3個重復的平均值，誤差條代表1個標準差；

（G）C. sporogenes需要otc從精氨酸產生ATP。顯示在含有2 mM精氨酸的PBS中培養(yǎng)的C. sporogenes的細胞內ATP水平。

（H）C. sporogenes中精氨酸代謝途徑。基于這些數(shù)據，作者認為精氨酸是通過假定的精氨酸脫氨基酶CLOSPO_00894轉化為瓜氨酸的；瓜氨酸隨后被推測的鳥氨酸轉氨基甲酰基酶CLOSPO_02415水解為鳥氨酸和氨基甲?；姿?，導致ATP的產生。

為了確定菌株與氨基酸的相互作用，作者利用大多數(shù)氨基酸缺失對大多數(shù)菌株影響不大的事實，將各條件下相對豐度明顯偏離平均值的菌株制作成表格（圖2B）。當該菌群在完全確定的培養(yǎng)基中繁殖時，相對豐度跨越了6個數(shù)量級。36%的菌株相對豐度為10^?4~10^?2，8株為＞10^?2，50株為＜10^?4（圖2B）。與模擬結果一致，NinjaMap對相對豐度低至10^?6的菌株敏感，能夠量化56%低于10^?3檢測限的菌株，通常用于宏基因組分析。因此，作者的系統(tǒng)能夠研究低豐度的微生物，其中一些已知具有很大的生物影響。

為了確定顯著的響應，作者計算了每個菌株在實驗中的相對豐度的標準差，并計算了Z分數(shù)（圖2C）。以前在單一培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)的菌株-氨基酸相互作用也在菌群中觀察到。在缺乏甲硫氨酸的培養(yǎng)基中生長的菌群中Anaerostipes caccae相對豐度下降（Z = -3.48）。同樣，C. sporogenes受亮氨酸缺乏（Z = -2.56）影響，亮氨酸是一種氧化脫羧以異戊酸生成電子的底物。這些觀察結果表明，盡管100個菌株在競爭相同的營養(yǎng)物質，但在復雜多樣的菌群中，消除一個氨基酸對一個菌株生長的影響是很容易觀察到的。

大多數(shù)菌株對氨基酸去除有反應的情況不超過4例（圖2B）。此外，相對豐度表現(xiàn)出較低的變異性，菌株間log₁₀(相對豐度)的平均標準差小于0.43。在超過4例中，只有3個株菌（均為厚壁菌門）對氨基酸去除有反應：Lactococcus lactis DSM 20729，Clostridium sporogenes ATCC 15579和Lactobacillus ruminis ATCC 25644。因此，在這些生長條件下，大多數(shù)菌株在很大程度上對氨基酸去除不敏感，而少數(shù)菌株則高度敏感。作者注意到，菌株對氨基酸去除的反應可能是直接的（如，由于能量的利用）或間接的（如，氨基酸去除影響相互作用的菌株）。

氨基酸對菌群組成的影響差異很大（圖2D）。超過一半的菌株對半胱氨酸去除有反應，可能是由于它作為還原劑的作用。超過5%的菌株對去除甲硫氨酸、組氨酸、異亮氨酸、精氨酸、纈氨酸和酪氨酸有反應，而對于8種氨基酸，菌群沒有明顯變化（圖2D）。有趣的是，相似氨基酸之間存在很大差異：沒有菌株對賴氨酸的去除有反應，而10.6%和7.6%的菌株對組氨酸和精氨酸的去除有反應。異亮氨酸、亮氨酸和精氨酸的去除對菌群結構的影響尤其大：當在完全培養(yǎng)基中生長時，C. sporogenes和L. lactis這兩種是最豐富的菌株，當這些氨基酸中的任何一種被去除時，相對豐度下降了500倍（圖2E）；在生物重復實驗中也觀察到這種敏感性。綜上所述，這些數(shù)據表明，一些氨基酸是“關鍵”營養(yǎng)素，在決定菌群組成方面起著重要作用。

在篩選的86個候選菌株-氨基酸相互作用中，對涉及C. sporogenes的相互作用特別感興趣。雖然C. sporogenes可以氧化和還原芳香氨基酸，但其相對豐度不受苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸去除的影響。亮氨酸、異亮氨酸和精氨酸的去除對C. sporogenes生長的影響較大。第二敏感的表型是缺乏精氨酸時相對豐度的降低（圖2E）；雖然已知C. sporogenes代謝精氨酸，但在先前的工作中未觀察到精氨酸對生長或能量代謝的影響。為了驗證和表征這種相互作用，作者比較了C. sporogenes在完全培養(yǎng)基和精氨酸缺乏培養(yǎng)基中的生長。雖然C. sporogenes在完全培養(yǎng)基中生長良好，但在缺乏精氨酸的情況下表現(xiàn)出很大的生長缺陷（圖2F），表明這種氨基酸是生長的重要底物。

C. sporogenes可以利用其他氨基酸作為底物來支持ATP合成。假設精氨酸也是如此，作者在缺乏ATP合成底物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)野生型C. sporogenes。添加精氨酸后，胞內ATP水平急劇上升（圖2G），表明C. sporogenes直接或間接地從精氨酸產生ATP。

為了確定參與這一過程的酶，作者分析了C. sporogenes的基因組，以尋找已知的從精氨酸中捕獲能量的途徑。精氨酸脫亞胺酶途徑的三個步驟中的每一個步驟都找到了候選基因（圖2H）。精氨酸脫亞胺酶催化精氨酸凈轉化為鳥氨酸、二氧化碳和兩個當量的銨，產生一個當量的ATP。利用最近開發(fā)的一種方法來構建C. sporogenes的無痕缺失，產生了缺乏精氨酸脫亞胺酶（CLOSPO_00894， Δadi）或鳥氨酸氨基甲酰轉移酶（CLOSPO_02415，Δotc）的菌株。Δotc突變體不能產生ATP以響應精氨酸的供給，這與精氨酸脫亞胺酶途徑在C. sporogenes能量產生中的作用一致（圖2G）。相比之下，Δadi突變體在精氨酸誘導的ATP產生方面沒有缺陷，這表明可能有另一種途徑從精氨酸產生瓜氨酸。與這些觀察結果一致，Δotc突變體在完全培養(yǎng)基中生長缺陷（圖2F）。而是Δadi突變體是局部的，表明在這個條件下，另一種途徑可以從精氨酸產生能量。總之，這些結果表明，精氨酸脫亞胺酶途徑的精氨酸代謝直接有助于細胞產生ATP，增加了作者對氨基酸代謝途徑如何促進復雜菌群中腸道共生適應性的理解。

作者設計hCom1的核心目標是在宿主定殖的背景下進行微生物組的機制研究。作為體內工作的起點，用hCom1定殖無菌Swiss-Webster （SW）小鼠（圖3A），通過單獨繁殖每個菌株并基于OD標準化混合菌株培養(yǎng)物來制備hCom1。每周采集小鼠糞便，連續(xù)8周，通過宏基因組測序和NinjaMap進行序列分析對每個糞樣中的菌群組成進行計數(shù)。

首先，接種物中幾乎所有菌株都在小鼠腸道定殖（圖3B和3C）。接種物中存在103/104菌株；其中，101個菌株至少在小鼠體內檢測到一次。在小鼠中檢測不到的3株菌株為：Ethanoligenens harbinense YUAN-3、Clostridium methylpentosum DSM 5476和Ruminococcus albus 8，它們生長緩慢且培養(yǎng)難度大。雖然菌株的相對豐度跨越了6個數(shù)量級，但在4個籠子的20只小鼠中，幾乎所有菌株的變異都很低，變異系數(shù)（CV）為0.4。

其次，菌群迅速達到穩(wěn)定的狀態(tài)（圖3D）。在小鼠中平均定殖2周后菌株相對豐度基本保持不變，不同重復實驗第8周物種組成的Pearson相關系數(shù)＞0.95。第一周后，相對豐度在實驗期間保持在一個狹窄的范圍內（96個高于檢測限菌株的平均CV＜0.2）。相對豐度變化大的菌株很少：只有27/312（8.7%）的菌株在相鄰周的變化超過10倍。

雖然hCom1是由來自人類腸道微生物組的常見物種組成，但它并不像人類糞便菌群那樣復雜或系統(tǒng)發(fā)育豐富；決定其成員資格的過程并不是為了確保任何功能或生態(tài)標準的完整性而設計的。為了創(chuàng)建一個確定的菌群，更好地模擬腸道微生物組，作者試圖通過增加hCom1在胃腸道中填充的生態(tài)位數(shù)量來強化hCom1（圖4A），因而設計了一個基于定殖抵抗原理的實驗策略，這是一種生態(tài)事件，在這種生態(tài)現(xiàn)象中，常駐生物將入侵物種排除在已占據的生態(tài)位之外。作者用hCom1在無菌小鼠中定殖4周，推測這些物種填滿了代謝和生態(tài)空間。然后用三個微生物組分不確定的糞便樣本（Hum1-3）的一個入侵這些小鼠，因為入侵物種將會占據已經被hCom1填充的生態(tài)位，而生態(tài)位未被填充就會允許入侵物種與hCom1共存。四周后使用宏基因組測序分析糞便顆粒中的菌群組成。

為了確定每個糞便樣本中哪些物種在hCom1存在的情況下定殖，作者分析了5-8周收集的糞便顆粒的組成，將物種劃分為“輸入”（hCom1來源，input）或“入侵者”（糞便樣本來源，invader）。作者使用了MIDAS（這是一個列舉工具，與NinjaMap不同，它不需要事先了解組成菌株）。MIDAS和NinjaMap對來自hcom1定殖小鼠讀序分析的相對豐度譜高度一致，使用MIDAS對部分或完全不確定的樣品進行后續(xù)分析。

使用MIDAS，無法確定在入侵前和入侵后出現(xiàn)的菌株是來自hCom1（即原始菌株持續(xù)定殖）還是來自糞便樣本（即新菌株取代了原始菌株）。為了進一步了解菌株替換與保留，從入侵后4周（第8周）采集的樣本中招募了一個由hCom1基因組序列組成的數(shù)據庫，只使用與一個或多個基因組100%相同的讀序。將分析重點放在高覆蓋深度（≥10倍）的基因組上。這些菌株中超過60%（≥95%）被完全匹配的讀序廣泛覆蓋，這表明大多數(shù)菌株在入侵前從hCom1保留或者是密切相關的菌株。

如預期一樣，添加生理鹽水的小鼠在沒有顯示出新物種增加 （圖4B）。糞便樣本入侵hCom1定殖的小鼠中，第8周平均89%的基因組拷貝來自hCom1 （58%的MIDAS-bin）（圖4B）。剩下的11%的基因組拷貝（42%的MIDAS-bin）代表了來自入侵的糞便樣本。盡管增加了新物種，但菌群結構保持不變（圖4C）：移植后hCom1物種的相對豐度與移植前水平高度相關 （Pearson’s r ＞ 0.85）（圖4D）。因此，hCom1對人類糞便的入侵具有廣泛但不完全的抗性。

觀察到糞便入侵后形成的菌群中僅有一小部分是后來形成的新物種，作者假設可以通過添加成功入侵的物種來提高hCom1的定殖抗性，從而提高其填充腸道生態(tài)位的能力。在3個獨立實驗中檢測到有24個細菌至少2次成功入侵了hCom1，說明24個細菌更有可能填補菌群中的生態(tài)位。作者獲得了其中的22個細菌并將其全部添加到新的菌群（hCom2）（非從糞便培養(yǎng)），同時去除了入侵前無法定殖和遷移的7個細菌物種。因此新菌群（hCom2）包含97株來自hCom1的菌株和22株新菌株，共119株（圖4A）。這22個菌株主要為厚壁菌門或另枝菌屬（Alistipes），許多代表了在hCom1中系統(tǒng)發(fā)育上未被充分代表的分類群，這表明它們可能能夠占據由hCom1成員留下的空缺的生態(tài)位（圖S1）。

然后作者用hCom2定殖四組無菌SW小鼠，每周收集糞便顆粒（圖4A）。使用NinjaMap分析宏基因組測序數(shù)據來測量菌群組成（圖5A）。hCom2處理后小鼠的腸道菌群結構迅速達到穩(wěn)定 （與第八周的穩(wěn)定菌群相比，Pearson’s r ＞ 0.97）（圖S2），119株中有100株高于檢出限，hCom1衍生菌株在強化菌群中以相似的相對豐度定殖（圖5B）。hCom2新物種的相對豐度范圍跨度較大，Bacteroides rodentium成為最豐富的物種，而低豐度的Blautia sp. KLE 1732的平均豐度為10^?4（圖5B）。

構建hCom2的目的是通過其在腸道中占據生態(tài)位的能力來提高其完整性。為了測試hCom2是否比hCom1更完整，在第5周開始時用與入侵hCom1相同的糞便樣品入侵hCom2定殖小鼠，以便比較入侵實驗之間的結果。重要的是，用于增強hCom1的22株菌株來自培養(yǎng)物而不是糞便樣本本身，這降低了hCom2和糞便樣本在菌株水平上有重疊隸屬關系的可能性。事實上，通過在hCom2中招募新生物體的基因組測序讀序，發(fā)現(xiàn)17/22被完全匹配的讀序廣泛覆蓋（≥95%），這與它們來自hCom2而非入侵糞便樣本的觀點一致。

從第8周開始，平均96%的基因組拷貝（81%的MIDAS-bin）來自hCom2中的菌株（圖5C），表明hCom2的定殖抗性明顯優(yōu)于hCom1（圖5D）。其余4%的讀序（19%的MIDAS-bin）代表了在hCom2存在下入侵的物種（圖5D）。幾乎所有入侵hCom2定殖小鼠的物種也入侵了hCom1定殖小鼠（圖5E）；要么無法獲得包含在hCom2中的分離物，要么入侵hCom1的物種僅在3個糞便樣本入侵實驗中出現(xiàn)1次，低于作者的篩選標準，這些物種幾乎代表了所有剩余的基因組拷貝。作者得出結論：基于一次入侵實驗強化的合成菌群可能會進一步增強入侵抗性。

而且，與hCom1相比，hCom2被入侵后的組成更接近入侵前狀態(tài)（Pearson’s r＞0.95；圖5F）。綜上所述，這些數(shù)據表明hCom2比hCom1更穩(wěn)定和完整，并且在識別可以占據未填充生態(tài)位的物種時，增強過程具有魯棒性和容錯性。

在之前的實驗中，作者用最初增強實驗中使用的相同糞便菌群Hum1-3入侵了hCom2定殖小鼠（圖4）。接下來，作者試圖確定hCom2是否能夠抵御不相關糞便菌群的入侵。hCom2定殖小鼠被Hum4-6入侵后的組成與Hum1-3入侵后組成不同（圖4A）。hCom2對不相關的糞便樣本的入侵不太穩(wěn)定：從第8周開始，平均81%的基因組拷貝（58%的MIDAS-bin）來自hCom2（圖5D）。因此，hCom2對不相關糞便樣本的入侵具有廣泛但不完全的抗性。

作者建立一個復雜確定菌群的最初目的是為腸道微生物組開發(fā)一個模型系統(tǒng)。在證明了hCom2對入侵具有穩(wěn)定性和彈性后試圖評估它是否具有模型系統(tǒng)的功能屬性。

首先探究了其菌群結構與人類糞便菌群的結構的相似性。用3份人類糞便樣本定殖無菌小鼠（Hum1-3，即人源化小鼠），并將其菌群組成與hCom2定殖小鼠的菌群組成進行比較。hCom2定殖和人源化小鼠的腸道菌群在三個方面相似（圖5G, 5H）。首先，相對豐度至少跨越了5個數(shù)量級，一些菌株的定殖率保持在10%左右，而另一些則在0.001%左右。其次，對數(shù)相對豐度分布集中在低于0.01%區(qū)間，表明菌群中的大多數(shù)菌株將被0.1%的檢出限的枚舉工具遺漏。第三，分類群的相對豐度在屬水平上是相似的。因此，hCom2定殖的小鼠菌群與人源化小鼠腸道菌群結構相似。

接下來討論了可重復性的問題，這是一個實驗模型系統(tǒng)的基本要求。首先分析了第二次糞便入侵實驗（Hum1-3）的數(shù)據，以評估hCom2定殖小鼠菌群組成的技術可重復性。第4周，同一hCom2接種劑定殖的全部4個籠中的20只小鼠腸道微生物豐度高度相似（Pearson相關系數(shù)為0.96 ± 0.01）。

生物可重復性是一個更大的問題。考慮到hCom1和hCom2的復雜性，單個菌株的生長差異可能導致不同天數(shù)構建的接種物組成存在實質性差異。為了確定這種可變性對體內菌群結構的影響程度，作者比較了四組小鼠的菌群組成，這些小鼠在不同時間被獨立構建的hCom2定殖（圖6A 6B）。4周后，菌群的相對豐度顯示出驚人的相似性（所有生物重復對之間的Pearson大于0.95）。因此，相對恒定的營養(yǎng)環(huán)境可以使相對豐度變化很大的輸入菌群達到相同的穩(wěn)態(tài)配置，這與其他微生物組的生態(tài)觀察結果一致。這種高度的生物可重復性將使使用復雜的已定義菌群作為實驗模型成為可能。

為了進一步研究hCom2作為模型微生物組的潛力，作者在另外一種小鼠中進行了評估。用hCom2定殖無菌129/SvEv小鼠，并在定殖4周后收集糞便顆粒。結果顯示：其菌群組成與SW小鼠高度相關（Pearson相關系數(shù)大于0.95）。這些數(shù)據表明，hCom2與人類腸道微生物組一樣，對宿主基因型的變化具有很強的抵抗力。

進行了三個額外的實驗來確定hCom2定殖的小鼠與人類糞便菌群定殖的無菌小鼠的相似程度。由于確定的菌群是由人類糞便分離物組成的，作者將確定的hCom2菌群或微生物不明確的人類糞便菌群處理無菌小鼠，并在4周后檢測表型（圖6A）。首先，將每只小鼠的糞便顆粒梯度稀釋，并涂于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)皿上，以估計每個菌群的細菌細胞密度。每組每克糞便含有10¹¹~10¹²個菌落形成單位（圖6C），與已報道的人類、傳統(tǒng)小鼠和人源化小鼠的估計相似。因此，hCom2在小鼠腸道中的定殖密度與正常小鼠或人類糞便菌群相似。

接下來，作者研究了hCom2定殖小鼠是否具有與人源化小鼠相似的免疫細胞譜。作者提取了結腸免疫細胞并對其進行染色和流式細胞檢測，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)免疫細胞亞型，包括CD4+ T細胞、IgA+ B細胞、巨噬細胞、CD11b+樹突狀細胞和單核細胞，在人源化小鼠與hCom2定殖的小鼠中同樣豐富（圖6D），表明hCom2定殖小鼠與人源化小鼠在廣義上的免疫細胞譜相似。

最后，為了確定hCom2定殖小鼠和人源化小鼠是否具有相似的微生物組代謝物，作者使用靶向代謝組學分析了糞便顆粒和尿液樣本。結果顯示，hCom2定殖小鼠和人源化小鼠尿液中的芳香氨基酸代謝物水平（圖6E）和糞便中的初級和次級膽汁酸水平（圖6F）是相當?shù)?。綜上所述，這些數(shù)據表明hCom2是一個合理的腸道微生物代謝模型。

為了證明其作為模型系統(tǒng)的實用性，作者使用hCom2來研究腸道菌群的一個新特性：它們抵抗病原體定殖的能力。為了測試hCom2是否具有定殖抗性，作者研究了腸出血性大腸桿菌（EHEC） Escherichia coli ATCC 43894。選擇這個物種的三個原因是：首先，腸出血性大腸桿菌會導致危及生命的腹瀉感染和溶血性尿毒癥綜合征，其他大腸桿菌菌株的腸道定殖與營養(yǎng)不良和炎癥性腸病有關；其次，對大腸桿菌和其他腸桿菌科的定殖抗性進行了詳細研究，但負責的共生菌株及其作用機制尚不完全清楚；最后，hCom2沒有腸桿菌科，只有3種變形菌門（Desulfovibrio piger, Bilophila wadsworthia和Burkholderiales bacteria 1-1-47），因此，對大腸桿菌定殖抗性需要用除生態(tài)位的另一種生態(tài)位進行解釋。

為了測試hCom2是否能夠抵抗腸出血性大腸桿菌的入侵定殖，分別用hCom2、12Com（類似于先前研究中使用的12個成員菌群）和來自健康人類的不確定糞便菌群定殖無菌SW小鼠 （圖7A），hCom2和12Com不含任何腸桿菌科。為了測試非致病性腸桿菌科是否增強了對腸出血性大腸桿菌的定殖抗性，作者在另外在定殖的hCom2和12Com菌群中添加了7種非致病性腸桿菌科菌株的混合物（大腸桿菌MITI 27、MITI 117、MITI 135、MITI 139、MITI 255、MITI 284和陰溝腸桿菌MITI 173；稱為“Enteromix”）。4周后，用腸出血性大腸桿菌入侵，并在好氧生長條件下通過選擇性平板涂布培養(yǎng)檢測入侵情況（圖7A）。

與先前的報告一致，不確定的人類糞便菌群對腸出血性大腸桿菌定殖具有強大的抵抗力（圖7B和7C）。相比之下，12Com允許更高水平的腸出血性大腸桿菌定殖，并且在12Com中添加Enteromix改善了表型，但沒有完全恢復對腸出血性大腸桿菌的定殖抗性（圖7B）。缺乏腸桿菌科hCom2表現(xiàn)出與不確定的糞便菌群相似的腸出血性大腸桿菌抗性水平（圖7B）。因此，hCom2能足夠完整地表現(xiàn)出與原生糞便菌群相當?shù)亩ㄖ晨剐浴?/p>

為了確定hCom2中哪些物種負責腸出血性大腸桿菌定殖抗性，作者構建了四個菌群，依次去除了厚壁菌門，疣微菌門，放線菌門和變形菌門的所有物種，將這些門缺失菌群定殖在小鼠體內，然后用腸出血性大腸桿菌進行入侵 （圖7D）。放線菌門菌群缺失（10株）和疣微菌門菌群缺失（1株，Akkermansia muciniphila）對腸出血性大腸桿菌的抵抗性與hCom2菌群相當（圖7E和7F），而變形菌門或厚壁菌門菌群缺失的合成菌群更容易受到腸出血性大腸桿菌入侵。

厚壁菌門菌群缺失的合成菌群（ΔFirmicutes）對腸出血性大腸桿菌入侵高度敏感（圖7E），該缺陷導致hCom2定殖小鼠和ΔFirmicutes定殖小鼠之間的生存差異很大（圖7E右）。這些結果表明，厚壁菌門可能在腸出血性大腸桿菌抗性中發(fā)揮作用，或者它們的去除引起菌群結構變化使菌群對入侵敏感。通過更精確的菌株去除實驗進行進一步研究可能會發(fā)現(xiàn)具有抵抗腸出血性大腸桿菌入侵的菌株，有助于針對性的微生物治療以抵抗腸出血性大腸桿菌定殖和感染。

通過開發(fā)一個既明確又相當復雜的菌群生成了一個模型系統(tǒng)，該系統(tǒng)捕獲了原生微生物組的大部分生物學特性。但是該模型在未來仍然需要改進，包括額外的細菌、古細菌、真菌和病毒來占據未填補的生態(tài)位，這些都腸道生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。

測序數(shù)據比對計算流程開發(fā)使得分析復雜且明確的菌群具有較高的精度和靈敏度。這個方法可以量化相對豐度跨越6個數(shù)量級的菌群結構，從而可以揭示在菌群功能和動態(tài)中發(fā)揮重要作用的低豐度菌群成員。在如此復雜的系統(tǒng)中，技術和生物可重復性的程度（圖6B）是顯著的，這對未來的實驗工作來說是個好兆頭。

在強化一個已明確菌群的過程中有兩個意想不到的發(fā)現(xiàn)。首先，由來自100個不同供體的菌株組成的菌群在體內是穩(wěn)定的。在由單一供體（菌株共存多年）和多個供體（菌株沒有共存歷史）組成的菌群之間，是否存在明顯的穩(wěn)定性差異（或精細尺度的基因組和表型適應性差異）還有待觀察。如果一個沒有共同歷史的菌株集合可以形成一個穩(wěn)定的合成菌群，那么確定優(yōu)先效應（即到達順序）及空間和代謝生態(tài)位占據的作用將是有趣的。

其次，本研究中強化菌群的過程具有出乎意料的穩(wěn)定性和容錯性。最值得注意的是，所有入侵hCom1的來自糞便菌群菌株如Alistipes，Blautia，Bilophila，Oscilibacter和變形菌門在hCom1中系統(tǒng)發(fā)育缺少（圖S1）。此外，大多數(shù)入侵hCom2的菌株都曾入侵過hCom1，表明生態(tài)位填充是確定性的。重要的是，強化過程對現(xiàn)有菌群的結構造成的擾動相對較小。雖然擴充強化過程只能填補從小鼠到人類保守的生態(tài)位，但大多數(shù)人類菌株移植的觀察表明，許多生態(tài)位是保守的。

如果擴大菌株選擇標準，可能進一步提高菌群一輪強化后的定殖抗性。若要進一步增強生態(tài)位填充和菌群穩(wěn)定性，可以使用來自不同飲食的其他供體糞便樣本對hCom2強化。它也可能改善生態(tài)位占用，如在腸道炎癥的情況下，通過在炎癥性腸病的小鼠模型中執(zhí)行增強過程。

目前迫切需要一種通用的腸道微生物組模型系統(tǒng)，該系統(tǒng)必須是完全確定的且足夠復雜以維持一個完整菌群的大部分生物學特征。作者表明，hCom2是這樣一個系統(tǒng)的基礎：盡管它很復雜，但它以一種高度可復制的方式在小鼠中定殖。此外，hCom2忠實地模擬了人源化小鼠的生態(tài)容納量、免疫細胞譜和代謝表型。在代謝和免疫方面仍然存在一些適度的差異，并且該菌群仍然缺少某些可能重要的分類群。盡管如此，綜合起來，作者的研究結果表明hCom2是建立腸道微生物組模型的合理基礎。

這種系統(tǒng)最有趣的可能性之一將是在菌群移植實驗的下游進行還原論實驗（例如，識別負責微生物組相關表型的菌株）。雖然沒有確定對腸出血性大腸桿菌產生定殖抗性的菌株，但作者發(fā)現(xiàn)，去除變形菌門或厚壁菌門的物種會使菌群對腸出血性大腸桿菌敏感。在未來，嘗試一次從菌群中去除一個或幾個菌株可以進一步縮小從門水平到單個菌株的范圍。鑒定微生物組相關表型的菌株，包括對癌癥免疫治療的反應，熱量收獲和神經發(fā)育，將會引起極大的關注。

Cheng A G, Ho P Y, Aranda-Díaz A, et al. Design, construction, and in vivo augmentation of a complex gut microbiome[J]. Cell, 2022, 185（19）: 3617-3636. e19.