要想最大程度地發(fā)揮治療潛力，提高工程細(xì)胞的療效和安全性，往往需要在細(xì)胞中表達(dá)大片段基因或復(fù)雜的基因回路。例如在構(gòu)建CAR-T細(xì)胞時(shí)，通過在T細(xì)胞中導(dǎo)入嵌合抗原受體（CAR）基因，從而改善T細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的殺傷能力。CRISPR激活（CRISPRa）、CRISPR干擾（CRISPRi），以及邏輯門，可以進(jìn)一步增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞治療效果，但其在原代細(xì)胞中的長(zhǎng)期表達(dá)仍然是一大挑戰(zhàn)。轉(zhuǎn)基因沉默（Transgene silencing）是使用這些工具進(jìn)行復(fù)雜細(xì)胞工程和治療時(shí)面臨的主要障礙。這一現(xiàn)象指的是，使用慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體整合在原代細(xì)胞中的基因會(huì)隨著時(shí)間推移而表達(dá)減少，甚至完全喪失。而這種現(xiàn)象往往在工具開發(fā)時(shí)被忽視了。2023年5月1日，斯坦福大學(xué)亓磊團(tuán)隊(duì)在 Nature Biomedical Engineering 期刊發(fā)表了題為：Stable expression of large transgenes via the knock-in of an integrase-deficient lentivirus 的研究論文。該研究開發(fā)了一種敲入和穩(wěn)定表達(dá)大片段DNA以及在兩個(gè)內(nèi)源位點(diǎn)同時(shí)敲入兩個(gè)基因的方法——CLIP（CRISPR for Long-fragment Integration through Pseudovirus）。利用整合酶缺陷慢病毒和Cas9-RNP，能夠以低細(xì)胞毒性在原代T細(xì)胞中高效插入和穩(wěn)定表達(dá)大片段DNA（6kb）和兩種難表達(dá)病毒抗原。CLIP為制造工程原代細(xì)胞提供了一種可擴(kuò)展、有效的新方法。要想在人類原代細(xì)胞中靶向插入和穩(wěn)定表達(dá)大片段基因，需要穩(wěn)健、高效和易于實(shí)現(xiàn)的方法。通過慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體遞送DNA，通常會(huì)將DNA半隨機(jī)插入宿主細(xì)胞基因組中，而這種方式還容易受到轉(zhuǎn)基因沉默的影響。利用同源定向修復(fù)（HDR）將有DNA片段置于細(xì)胞內(nèi)源性必需基因（例如表達(dá)actin-β蛋白的ACTB基因，actin-β是重要的細(xì)胞骨架蛋白）的上游和框內(nèi)，可以克服轉(zhuǎn)基因沉默的問題，但這通常會(huì)導(dǎo)致敲入效率低下和細(xì)胞毒性。為了克服這一障礙，亓磊團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種名為CLIP（CRISPR for Long-fragment Integration through Pseudovirus）的方法，實(shí)現(xiàn)了大片段DNA（可長(zhǎng)可達(dá)6kb）的敲入和穩(wěn)定表達(dá)，還能夠在兩個(gè)內(nèi)源性位點(diǎn)同時(shí)敲入兩個(gè)基因。使用慢病毒載體會(huì)將攜帶的DNA片段半隨機(jī)整合到基因組中，容易導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因沉默。而CLIP通過HDR介導(dǎo)的大片段DNA敲入必需基因位點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)具體來說，該方法利用了整合酶缺陷的慢病毒（IDLV）來編碼同源臂和“切割位點(diǎn)”兩側(cè)的有效載荷（大片段DNA），將有效載荷插入內(nèi)源性必需基因的上游和框架內(nèi)，然后通過電穿孔遞送CRISPR-Cas9的核糖核蛋白復(fù)合物（Cas9-RNP）。整合酶缺陷的慢病毒（IDLV）的整合酶發(fā)生了D64V突變，其維持了該酶包裝和核定位病毒基因組的能力，但顯著降低了其隨機(jī)整合到基因組中的能力。而電穿孔導(dǎo)入的Cas9-RNP在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生靶向DNA雙鏈斷裂，從而在該位點(diǎn)進(jìn)行同源定向修復(fù)（HDR），實(shí)現(xiàn)有效載荷（大片段DNA）的定向敲入。為了驗(yàn)證CLIP技術(shù)的效果，研究團(tuán)隊(duì)使用CLIP技術(shù)向原代T細(xì)胞中成功敲入了幾個(gè)之前難以表達(dá)的蛋白，包括新冠病毒的S蛋白、Cas13、dCas12a等等，并能維持期長(zhǎng)期表達(dá)。這有助于疫苗和抗體研究，還有助于開發(fā)更好的細(xì)胞療法。總的來說，開研究開發(fā)的CLIP技術(shù)能夠以低細(xì)胞毒性在原代T細(xì)胞中高效插入和穩(wěn)定表達(dá)大片段DNA（可長(zhǎng)達(dá)6kb），這為易沉默轉(zhuǎn)基因表達(dá)提供了一種新策略，為開發(fā)工程原代細(xì)胞療法提供了一種可擴(kuò)展和有效的新方法。
