轉基因小鼠常用于基因的過表達。根據制備策略，分為隨機轉基因和定點轉基因。隨機轉基因是將過表達載體注射到受精卵中，表達載體以隨機方式插入基因組，首建鼠可能有多個位點插入，每個插入位點可能含有多個表達載體拷貝。這個特點導致有的轉基因小鼠會發(fā)生表達沉默，因此需要對小鼠進行表達篩選，篩出正確表達的小鼠，進行建系才能用于后續(xù)實驗。定點轉基因是將基因表達載體插入到基因組特定位點上，如 Rosa26 位置，研究證明，這個位置不容易發(fā)生表達沉默，與隨機轉基因相比，優(yōu)勢是表達確定，但制備相對復雜，成本和周期增加。

圖 1：轉基因小鼠制備示意圖

來源：Yale J Biol Med. 2011 Jun;84(2):117-124

傳統(tǒng)策略是通過同源重組的方式，用 Neo 基因替換或刪除關鍵外顯子來敲除基因，其周期長，費用高。TALEN，CRISPR 技術出現后，加速了基因敲除鼠的制作，而且降低了費用。CRISPR 切割 DNA 后，會引起的非同源末端修復（NHEJ），這種修復有一定的隨機性，如果插入或刪除非 3 的整數倍的核苷酸，會發(fā)生移碼突變，造成基因敲除。移碼突變的策略只需要單個 gRNA，但是后期檢測一般需要測序，或者用分辨率更高的 Page 膠電泳，檢測相對復雜，成本較高。

圖 2：基因敲除小鼠制備示意圖

這里有個需要注意的雷是某些敲除雖然發(fā)生了移碼，但是蛋白水平檢測發(fā)現，未能敲除目的基因。目前維通達采用雙 gRNA 策略，刪除關鍵外顯子或整個目的基因，確保有效敲除目的基因，由于刪除了一個大的片段，PCR 檢測時，敲除小鼠很容易與野生型區(qū)別。

當目的基因敲除致死時，只能做條件敲除，常用 Cre-loxp 系統(tǒng)。那么如何操作呢？方法是在要敲除的區(qū)域兩側插入 loxp，得到的 floxed 小鼠與組織特異表達 Cre 的小鼠雜交，在 Cre 的作用下，兩個 loxp 之間的區(qū)域被刪除，可以實現在特異的組織敲除目的基因。條件敲除雖然也是敲除，但是制備這種小鼠實際是要定點插入 loxp 序列。

圖 3：條件敲除小鼠制備示意圖

某些疾病由單個堿基突變引起，通過突變小鼠的相應堿基可以模擬。CRISPR 打斷 DNA 的同時，提供含有目的突變的單鏈修復模板，能夠有效地建立點突變小鼠。影響點突變效率的主要因素是，該點突變附近有沒有高效率切割 DNA 的 gRNA，如果有，是比較幸運的，如果沒有，可以選取鄰近的 gRNA，這可能造成二次切割，需要引入同義突變。在這里提醒大家，切割位點離突變位點越遠，突變效率越低。

圖 4：點突變小鼠制備示意圖

CRISPR 打斷 DNA 的同時，提供打靶載體，能夠敲入外源 DNA。當需要敲入長度較小 DNA 片段時，CRISPR 能夠有效地提高效率，如維通達制作的免疫檢查點基因 PD1，CTLA4，Tim3，和 LAG3 的人源化小鼠，都是通過 CRISPR 技術，將小鼠的基因替換成人源的基因。對于 GFP 等各種標簽的插入也可以用 CRISPR 來幫助制備。

圖 5：基因敲入小鼠制備示意圖

雖然 TALEN 和 CRISPR 出現后，大大提高了基因編輯的能力，但 CRISPR 等技術也并非全能。隨著敲入片段長度的增加，大于 1kb 的片段時，CRISPR 等技術效率逐漸下降，而傳統(tǒng) ES 打靶周期長，費用高。由北京大學和維通達共同合作研發(fā)獲得的 EPS 細胞（cell 期刊號：169（2）：243-257.e25.），具有超強的胚胎嵌合能力，一個 ES 細胞注入囊胚，就可以直接生出 ES 小鼠，越過嵌合鼠的步驟，節(jié)省三個月的時間，費用也大為節(jié)省。